Ett protokoll för levande avbildning av GFP-märkta proteiner eller autofluorescerande strukturer i enskilda<em> Drosophila</em> Oocyter beskrivs.
Drosophila äggcellen har etablerats som ett mångsidigt system för att utreda grundläggande frågor såsom cytoskelett funktion, cell organisation och organell struktur och funktion. Tillgången på olika GFP-märkta proteiner innebär att många cellulära processer kan övervakas i levande celler under loppet av minuter eller timmar, och med hjälp av denna teknik har processer såsom RNP transporter, epitelial morfogenes och vävnadsombildning beskrivits i detalj i Drosophila oocyter 1,2.
Förmågan att utföra videobildhanteringsutrustning kombinerat med en rik repertoar av mutanter möjliggör en enorm variation av gener och processer som ska undersökas i otrolig detaljrikedom. Ett sådant exempel är processen att ooplasmic streaming, som initierar vid mitten oogenes 3,4. Denna kraftiga rörelse av cytoplasmiska blåsor är mikrotubuli och kinesin beroende 5 och ger en bra systemTEM för att utreda cytoskelett funktion på dessa stadier.
Här presenterar jag ett protokoll för tiden lapse avbildning av levande oocyter med praktiskt taget alla konfokalmikroskopi inställningar.
Drosophila oocyter är ett mångsidigt modellsystem för adressering olika frågor som rör funktion och organisation av celler och subcellulära komponenter. En fullständig förståelse av proteiners funktion kräver övervakning av både rumsliga och tidsmässiga aspekter av protein beteende. Framsteg inom både bildsystem och genetiska verktyg som finns för Drosophilists gör det möjligt även för små laboratorier för att utföra hög experiment bildkvalitet i levande oocyter. Här har jag beskriva ett protokoll för att analysera beteendet hos GFP-märkta eller autofluorescerande proteiner och strukturer under mitten till slutet-oogenes som kan användas tillsammans med en mängd genetiska bakgrunder för att undersöka proteiners funktion.
I detta protokoll beskriver jag den process genom vilken äggceller är förberedda för avbildning och de grundläggande konfokala inställningar som gör det möjligt förvärv av time lapse video av fluorescerande proteiner och strukturer. Ytterligare DetaiÄr på oocyt framställning beskrivs av Weil et al. Ett brett utbud av flyga stammar som uttrycker proteiner som har endogent taggade via exon-svällning är tillgängliga 8, och oändligt mycket mer protein varianter kan konstrueras och återinföras till flugor 6.
I arbetet med levande vävnad, är hälsa proverna av största vikt. Egg kammare från steg 10B kan fylla oogenes i ett väsentligen oberoende sätt 11, vilket gör dem idealiska för kortsiktiga imaging studier. Man måste vara försiktig vid flera viktiga steg för att få högkvalitativa data. Vid dissektion är det viktigt att manipulera äggstockar och oocyter så lite som möjligt, och för att minimera mängden tid mellan dissektion och slutförandet av avbildning. Helst ska en liten dissektion station placerad i samma rum som rymmer konfokala omfattning och endast ett fåtal ägg kammare i taget bör avbildas. Antalet rekommenderas här (5-8) Ser till att dissektion minimeras samtidigt som man maximerar sannolikheten att erhålla god kvalitet bilder. Jag rekommenderar att fånga en kort serie bilder för att bedöma bildkvalitet och bekräfta att fotograferingsinställningarna optimeras, innan du tar en längre sekvens tid förflutit. De flesta program tillåter enskilda bildrutor som ska sparas och dessa bilder kan sedan analyseras på olika sätt med hjälp av ImageJ 12 eller annan programvara.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag GM096076 från NIH AREA programmet.
Name | Company | Catalog number | Comments |
Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
#5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
Silicon grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
Glass-bottom Petri dishes | MatTek | P35G-0-20-C |