采用先进的3D荧光显微镜定量分析自噬
Summary
细胞自噬是一个无处不在的进程，使细胞蛋白质和细胞器的降解和回收利用。我们采用先进的荧光显微镜可视化和量化小，但必要的，与诱导自噬相关的物理变化，包括自噬体和溶酶体的形成和分布，以及他们融合成autolysosomes。
Abstract
手术虽然带有明显的阳痿和尿失禁的风险，前列腺癌是美国男性恶性肿瘤之间的主要形式，传统的化疗方法已基本成功。激素治疗是有效的，在早期阶段，但往往失败，并最终发展为激素难治性肿瘤。我们一直有兴趣在开发针对特定的肿瘤细胞代谢缺陷的疗法。我们最近发现，前列腺肿瘤细胞的特异性缺乏一种酶（精氨琥珀酸合成酶，或ASS）的合成中所涉及的氨基酸精氨酸1。这种情况会导致肿瘤细胞变得依赖于外生精氨酸，他们经过代谢应激游离精氨酸耗尽时由精氨酸脱亚胺酶（ADI）1,10。事实上，我们已经表明，人类前列腺癌细胞CWR22 RV1有效地杀死ADI依赖caspase的细胞凋亡和积极autophaGY（或macroautophagy）1,2,3。细胞自噬是一种进化上保守的过程，使细胞代谢多余的蛋白质在营养饥饿4,5溶酶体破裂。虽然这一途径的重要组成部分，良好的特点6,7,8,9，很多方面的分子机制仍不清楚-特别是，什么是自噬作用的前列腺癌细胞死亡响应ADI治疗后？为了解决这个问题，我们需要的实验方法来衡量的水平和程度在细胞中的自噬反应 – 因为没有已知的分子标记物，可以准确地跟踪这个过程中，我们选择了开发基于成像的方法，使用定量三维荧光显微镜11,12的 。
使用专门CWR22Rv1细胞自噬体和溶酶体的荧光探针标记，我们证明了收购3D图像栈或者无线defield卷积显微镜（以及后来的超高分辨率，结构照明显微镜），可以清晰地捕捉到自噬诱导的早期阶段。市售数字图像分析的应用程序，我们可以很容易地获得统计信息自噬体和溶酶体的数量，规模，分布和程度从任何成像细胞共存。这个信息让我们能够精确地跟踪在活细胞自噬的进展，使我们继续调查自噬作用在癌症化疗。
Protocol
Representative Results
Discussion
虽然被广泛接受为一个标准的方法来确认自噬反应6相同的系统（因为我们已经做了），定量三维成像提供了前所未有的信息和细节的复杂过程，细胞自噬对LC3荧光探针标记细胞直接观察。特别是，我们观察到自噬诱导后80分钟内，数百（如果不是数千）在活细胞中的自噬体形成。同样，我们观察到在自噬诱导溶酶体舱室的分布非常有趣的形态学变化。在一个给定的单元格，在自噬体的数?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
格兰特支持，国家科学基金会，美国国立卫生研究院NIH CA165263 CA150197：NIH CA150197S1（HJ功夫），：NIH CA150197S1（CA Changou）PHY-0120999 中心生物光子学科学与技术 （DL欧胜，庄花园街），国防部PC073420（RJ大胆），研究挪威理事会，：儿子里夫埃埃里克森旅游格兰特209286/F11（BS阿鲁瓦莉）。 HJ功夫也承认奥本社区癌症基金的支持。 RJ大胆也承认J.麦当劳养老的支持。
我们感谢珍妮博士伟仁西贡博士和吴柏文DesigneRx慷慨供给ADI。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Arginine Deiminase (ADI) | DesigneRx | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | 4042 | |
| Saponin | Sigma | S4521 | |
| Alexa anti-mouse 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Alexa anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21244 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| anti-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
| anti-Cadherin | Cell Signaling | #3195 | |
| SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
| 35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
| No.1, 22 mm coverslip | Corning | #2865-22 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1324G |
References
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