Аутофагия вездесущий процесс, который позволяет клеткам деградировать и переработку белков и органелл. Мы применяем передовые флуоресцентной микроскопии для визуализации и количественной небольшой, но существенный, физические изменения, связанные с индукцией аутофагии, в том числе формирование и распределение аутофагосом и лизосом, и их слияние в autolysosomes.
Рак предстательной железы является ведущей формой злокачественных новообразований среди мужчин в США, а операция несет в себе существенный риск импотенция и недержание мочи, традиционные химиотерапевтические подходы были в значительной степени неудачны. Гормональная терапия является эффективным на ранней стадии, но часто не с возможным развитием гормонорефрактерный опухолей. Мы были заинтересованы в разработке терапии, ориентированные на конкретные метаболические дефицита опухолевых клеток. Недавно мы показали, что клетки опухоли простаты в частности отсутствие фермента (argininosuccinate синтазы или АСС), участвующих в синтезе аминокислоты аргинина 1. Это состояние приводит к опухолевым клеткам, чтобы стать зависимыми от экзогенных аргинин, и они подвергаются метаболическому стрессу, когда свободного аргинина исчерпывается аргинин deiminase (ДСП) 1,10. Действительно, мы показали, что человеческие клетки рака простаты CWR22 Rv1 эффективно убит ADI с каспазы-независимого апоптоза и агрессивных autophaГр (или макроаутофагии) 1,2,3. Аутофагия эволюционно-консервативный процесс, который позволяет клеткам усваивать нежелательных белков лизосомальными пробоя при питании 4,5 голода. Хотя основные компоненты этого пути хорошо характеризуется 6,7,8,9, многие аспекты молекулярного механизма до сих пор неясны – в частности, какова роль аутофагии в смерти-ответ клеток рака простаты после лечения ADI ? Для того, чтобы ответить на этот вопрос, мы потребовали экспериментального метода для измерения уровня и степени аутофагической ответа в клетках – и так как нет никаких известных молекулярных маркеров, которые могут точно отслеживать этот процесс, мы решили развивать изображений подход, используя количественной флуоресцентной микроскопии 3D 11,12.
Использование CWR22Rv1 клеток, специфически-меченных флуоресцентными зондами для аутофагосомы и лизосом, мы показываем, что 3D-изображение, полученное стеки либо с Widefield деконволюцией микроскопии (а позднее, с супер-разрешения, структурированное освещения микроскопия) может четко захватить на ранних стадиях аутофагию индукции. С помощью коммерчески доступных цифровых приложений анализа изображений, мы можем легко получить статистическую информацию о аутофагосом лизосом и количество, размер, распределение и степень колокализации из любого отображаемого клетки. Эта информация позволяет нам точно отслеживать прогресс аутофагию в живых клетках и позволяет нашим продолжение расследования роли аутофагию в химиотерапии рака.
В то время как непосредственное наблюдение клетки помечены флуоресцентными зондами против LC3 широко применяется в качестве стандартного метода для подтверждения аутофагической ответ 6, количественные изображения в 3D и той же системе (как мы сделали) обеспечивает беспрецедентну…
The authors have nothing to disclose.
Грантовая поддержка: NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0120999 Биофотоники Центр Науки и Технологии (DL Wolfson, FYS Чжуан), DOD PC073420 (RJ Жирный), Научно-исследовательский Совет Норвегии, Leiv Eiriksson грант 209286/F11 (BS Ахлувалия). HJ Кунг также благодарит за поддержку Рыжий Общественный фонд рака фонда. RJ Жирный также благодарит за поддержку J. McDonald одаренность.
Мы благодарим доктора Дженни Вэй-Jen Кунг-и д-р Бор-на Вэнь У DesigneRx на щедрые поставки ADI.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
Arginine Deiminase (ADI) | DesigneRx | ||
HEPES | Sigma | H4034 | |
Casein | Sigma | C5890 | |
Paraformaldehyde | Fisher | 4042 | |
Saponin | Sigma | S4521 | |
Alexa anti-mouse 555 | Invitrogen | A21422 | |
Alexa anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21244 | |
LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
anti-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
anti-Cadherin | Cell Signaling | #3195 | |
SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
No.1, 22 mm coverslip | Corning | #2865-22 | |
Microscope slides | Globe Scientific | 1324G |