Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme
Summary
Biz bakteriyel FtsZ-ring yapısal organizasyonu, hücre bölünmesi için gerekli bir aparat soruşturma için görüntüleme yöntemi bir süper-çözünürlük tarif. Bu yöntem, fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) kantitatif görüntü analizi dayanır ve diğer bakteri sitoskeletal proteinleri ile uygulanabilir.
Abstract
Bakteriyel hücre bölünmesi midcell 1,2 de daha on temel proteinin koordineli montaj gerektirir. Bu sürecin temelinde bölünme planı 3,4 de FtsZ protein tarafından bir halka benzeri suprastructure (Z-ring) oluşumudur. Z-halka birden fazla tek sarmallı FtsZ protofilaments oluşur, ve Z-halka içinde protofilaments düzenlemesini anlama bir güç jeneratörü 5,6 olarak Z-halka montaj ve işlevi mekanizma fikir sunar. Bu bilgiler, geleneksel floresan ve elektron mikroskopi nedeniyle mevcut sınırlamalar zor kalmıştır. Geleneksel floresan mikroskobu ışığın kırınım sınırı (~ 200 nm) nedeniyle Z-halkasının bir yüksek çözünürlüklü görüntü sağlayamaz. Elektron cryotomographic görüntüleme küçük C. FtsZ protofilaments dağınık algıladı crescentus 7 hücreleri, ancak bu gibi büyük hücreleri uygulamak zordurE. coli ya da B. subtilis. Burada bir süper-çözünürlük floresans mikroskopi yöntemi uygulama tanımlamak, fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (PALM), kantitatif E. yapısal organizasyonu karakterize etmek coli Z-ring 8.
PALM görüntüleme hem yüksek uzaysal çözünürlük (~ 35 nm) ve hedef proteinleri açık olarak tanımlaması sağlamak için özel etiketleme sunmaktadır. Biz 405 nm 9 aktivasyonu üzerine kırmızı floresan (eksitasyon = 561 nm) ve yeşil floresan (eksitasyon = 488 nm) geçer photoactivatable floresan proteini mEos2 ile FtsZ etiketli. Bir hurma deney esnasında, tek FtsZ-mEos2 moleküller stokastik olarak aktive edilir ve tek molekül karşılık gelen pozisyonlarda sentroid <20 nm hassas bir şekilde tespit edilir. Z-halkasının bir süper çözünürlüklü görüntü sonra tüm tespit FtsZ-mEos2 moleküllerin Centroid pozisyonları atma tarafından yeniden yapılmıştır.
<p class = "jove_content"> Bu yöntemi kullanarak, biz Z-ring ~ 100 nm sabit bir genişliğe sahip ve üç boyutta birbirleriyle örtüşen FtsZ protofilaments gevşek bir paket oluştuğunu buldu. Bu veriler, Z-halka 10, hücre devre bağımlı değişiklikleri daha ileri araştırmalar için bir sıçrama sağlamak ve ilgili diğer proteinler ile uygulanabilir.Protocol
Representative Results
Discussion
PALM görüntüleri başka yollarla elde etmek zordur hedef protein moleküllerinin dağılımı ve düzenlenmesi detaylı analizi izin molekül sayısı ve hücre içindeki konumları hakkında bilgi içerir. Aşağıda PALM görüntülerin biyolojik alaka korurken doğru kantitatif bilgileri ayıklamak için alınması gereken önlemler özetlemektedir. Biz de en iyi canlı vs sabit hücreler kullanılarak elde edilebilir bilgileri inceleyebilirsiniz. Son olarak, biz hücre bölünmesi makine hakkında ek süper-çöz…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hibe: 5RO1GM086447-02.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| 50 x MEM Amino Acids | Sigma | M5550 | |
| 100 x MEM Vitamins | Sigma | M6895 | |
| IPTG | Mediatech | 46-102-RF | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Micrsocopy Sciences | 15710-S | |
| SeaPlaque GTG Agarose | Lonzo | 50111 | |
| 50 nm Gold Beads | Microspheres-Nanospheres | 790113-010 | |
| FCS2 Imaging Chamber | Bioptechs | ||
| Stage Adaptor | ASI | I-3017 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 1.45 NA, 60x Objective | Olympus | ||
| IXON EMCCD Camera | Andor Technology | DU897E | |
| 488-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
| 561-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
| 405-nm CUBE Laser | Coherent |
References
- Buddelmeijer, N., Beckwith, J. Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center. Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).
- de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase. Nature. 359, 254-256 (1992).
- Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ). J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).
- Bi, E. F., Lutkenhaus, J. FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli. Nature. 354, 161-164 (1991).
- Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).
- Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes. Science. 320, 792-794 (2008).
- Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. Embo J. 26, 4694-4708 (2007).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).
- Fu, G., et al. In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM). Plos One. , (2010).
- Huecas, S., et al. Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments. Biophys. J. , (2007).
- Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).
- Dai, K., Lutkenhaus, J. The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).
- Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
