Vi beskriver en super-oppløsning avbildningsmetode å sondere strukturelle organisering av den bakterielle FtsZ-ringen, en essensiell apparat for celledeling. Denne metoden er basert på kvantitative analyser av photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM) bilder og kan brukes til andre bakterielle cytoskeletal proteiner.
Bakteriell celledeling krever koordinert montering av mer enn ti viktige proteiner på midcell 1,2. Sentralt i denne prosessen er dannelsen av en ring-lignende suprastructure (Z-ringen) av FtsZ protein ved divisjonen planen 3,4. Z-ringen består av flere enkelt-trådede FtsZ protofilamenter, og forstå arrangementet av protofilamenter inni Z-ringen vil gi innsikt i mekanismen av Z-ringen montering og dets funksjon som en kraft generator 5,6. Denne informasjonen har vært unnvikende på grunn av gjeldende begrensninger i konvensjonell fluorescens mikroskopi og elektronmikroskopi. Konvensjonell fluorescensmikroskopi er stand til å gi et bilde med høy oppløsning av Z-ringen på grunn av diffraksjon grensen av lys (~ 200 nm). Elektron cryotomographic bildebehandling har oppdaget spredt FtsZ protofilamenter i små C. crescentus celler 7, men er vanskelig å anvende på større celler somE. coli eller B. subtilis. Her beskriver vi anvendelse av en super-oppløsning fluorescensmikroskopi metoden, Photoactivated Localization Mikroskopi (PALM) kvantitativt karakterisere strukturelle organisering av E. coli Z-ring 8.
PALM bildebehandling tilbyr både høy romlig oppløsning (~ 35 nm) og spesifikk merking for å aktivere entydig identifisering av mål proteiner. Vi merket FtsZ med photoactivatable fluorescerende protein mEos2, som skifter fra grønt fluorescens (eksitasjon = 488 nm) til rødt fluorescens (eksitasjon = 561 nm) ved aktivering ved 405 nm 9. Under en PALM eksperiment, er enkle FtsZ-mEos2 molekyler stokastisk aktivert og de tilsvarende Tyngdepunktet posisjonene til de enkle molekyler er bestemt med <20 nm presisjon. En super-oppløsning av Z-ringen blir deretter rekonstruert av superimposing sentroiden posisjonene alle oppdagede FtsZ-mEos2 molekyler.
<p class = "jove_content"> Ved hjelp av denne metoden, har vi funnet at Z-ringen har en fast bredde på ~ 100 nm, og er sammensatt av en løs samling av FtsZ protofilamenter som overlapper med hverandre i tre dimensjoner. Disse dataene gir et utgangspunkt for videre undersøkelser av cellesyklusen avhengige endringer av Z-ringen 10 og kan anvendes for andre proteiner av interesse.PALM bildene inneholder informasjon om molekyl teller og stillinger innenfor en celle, slik at detaljert analyse av fordelingen og arrangement av target proteinmolekyler som er vanskelig å oppnå på annen måte. Nedenfor skisserer vi forholdsregler som bør tas for å trekke nøyaktig kvantitativ informasjon og samtidig opprettholde det biologiske relevansen av PALM bilder. Vi har også utforske informasjon som kan være best oppnås ved hjelp av levende vs fast celler. Endelig foreslår vi veier for å skaffe ekstra …
The authors have nothing to disclose.
Grant: 5RO1GM086447-02.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
50 x MEM Amino Acids | Sigma | M5550 | |
100 x MEM Vitamins | Sigma | M6895 | |
IPTG | Mediatech | 46-102-RF | |
16% Paraformaldehyde | Electron Micrsocopy Sciences | 15710-S | |
SeaPlaque GTG Agarose | Lonzo | 50111 | |
50 nm Gold Beads | Microspheres-Nanospheres | 790113-010 | |
FCS2 Imaging Chamber | Bioptechs | ||
Stage Adaptor | ASI | I-3017 | |
Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
1.45 NA, 60x Objective | Olympus | ||
IXON EMCCD Camera | Andor Technology | DU897E | |
488-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
561-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
405-nm CUBE Laser | Coherent |