Super-resolution Imaging van de bacteriële Division Machinery
Summary
We beschrijven een super-resolutie beeldvorming methode om de structurele organisatie van de bacteriële FtsZ-ring, een essentieel inrichting voor celdeling sonde. Deze methode is gebaseerd op kwantitatieve analyses van fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) beelden en kan worden toegepast op andere bacteriële cytoskeleteiwitten.
Abstract
Bacteriële celdeling vereist de gecoördineerde verzameling van meer dan tien essentiële eiwitten op midcell 1,2. Centraal in dit proces is de vorming van een ringvormige suprastructuur (Z-ring) van de FtsZ eiwit op perceelsgrenzen 3,4. De Z-ring uit meerdere enkelstrengs FtsZ protofilamenten en begrijpen van de opstelling van de protofilamenten in de Z-ring inzicht in het mechanisme van Z-ringarmatuur en zijn functie als krachtgenerator 5,6. Deze informatie is moeilijk te realiseren vanwege huidige beperkingen in conventionele fluorescentie microscopie en elektronenmicroscopie. Conventionele fluorescentiemicroscopie staat is een hoge resolutie van de Z-ring door de diffractielimiet van licht (~ 200 nm) te verschaffen. Electron cryotomographic beeldvorming heeft gedetecteerd verspreid FtsZ protofilamenten in kleine C. crescentus cellen 7, maar is moeilijk toepasbaar op grotere cellen zoalsE. coli of B. subtilis. Hier de toepassing van een super-resolutie fluorescentie microscopie methode beschrijven, fotogeactiveerde Localization Microscopy (PALM) kwantitatief kenmerken de structurele organisatie van de E. coli Z-ring 8.
PALM beeldvorming biedt zowel een hoge ruimtelijke resolutie (~ 35 nm) en specifieke etiketteringsvoorschriften om eenduidige identificatie van doeleiwitten mogelijk te maken. We gelabeld FtsZ de fotoactiveerbare fluorescerend eiwit mEos2, die van groene fluorescentie (excitatie = 488 nm) schakelt rode fluorescentie (excitatie = 561 nm) bij activering bij 405 nm 9. Tijdens een PALM experiment, worden enkele FtsZ-mEos2 moleculen stochastisch geactiveerd en de bijbehorende zwaartepunt posities van de individuele moleculen worden bepaald met <20 nm precisie. Een super-resolutie afbeelding van de Z-ring wordt vervolgens gereconstrueerd door superpositie van het zwaartepunt posities van alle gedetecteerde FtsZ-mEos2 moleculen.
<p class = "jove_content"> Met deze methode is dat de Z-ring een vaste breedte van ~ 100 nm heeft en bestaat uit een losse bundel FtsZ protofilamenten die met elkaar overlappen in drie dimensies. Deze gegevens fungeren als aanknopingspunten voor verder onderzoek van de celcyclus afhankelijke veranderingen van de Z-ring 10 en kan worden toegepast op andere eiwitten van belang.Protocol
Representative Results
Discussion
PALM beelden bevatten informatie over molecule telt en posities binnen een cel, waardoor gedetailleerde analyse van de verdeling en plaatsing van doeleiwit moleculen die moeilijk te bereiken met andere middelen. Hieronder geven we een overzicht van voorzorgsmaatregelen die moeten worden genomen om accurate kwantitatieve informatie halen met behoud van de biologische relevantie van PALM beelden. We verkennen ook de informatie die het best kan worden verkregen met behulp van live vs vaste cellen. Tot slot raden we mogelij…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grant: 5RO1GM086447-02.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| 50 x MEM Amino Acids | Sigma | M5550 | |
| 100 x MEM Vitamins | Sigma | M6895 | |
| IPTG | Mediatech | 46-102-RF | |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Micrsocopy Sciences | 15710-S | |
| SeaPlaque GTG Agarose | Lonzo | 50111 | |
| 50 nm Gold Beads | Microspheres-Nanospheres | 790113-010 | |
| FCS2 Imaging Chamber | Bioptechs | ||
| Stage Adaptor | ASI | I-3017 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| 1.45 NA, 60x Objective | Olympus | ||
| IXON EMCCD Camera | Andor Technology | DU897E | |
| 488-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
| 561-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
| 405-nm CUBE Laser | Coherent |
References
- Buddelmeijer, N., Beckwith, J. Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center. Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).
- de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase. Nature. 359, 254-256 (1992).
- Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ). J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).
- Bi, E. F., Lutkenhaus, J. FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli. Nature. 354, 161-164 (1991).
- Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).
- Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes. Science. 320, 792-794 (2008).
- Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. Embo J. 26, 4694-4708 (2007).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).
- Fu, G., et al. In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM). Plos One. , (2010).
- Huecas, S., et al. Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments. Biophys. J. , (2007).
- Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).
- Dai, K., Lutkenhaus, J. The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).
- Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
