Kvantifisere Glomerular permeabilitet i Fluorescent Macromolecules Bruke 2-Photon Mikroskopi i München Wistar rotter

Summary

En teknikk utnytte høy oppløsning intavital 2-foton mikroskopi å direkte visualisere og kvantifisere gloemrular filtrering i overflaten glomeruli. Denne metoden gjør det mulig for direkte bestemmelse av permeabilitet av makromolekyler i både normale og syke tilstander.

Abstract

Kidney sykdommer som involverer tap av store urin-essensielle makromolekyler, slik som serumalbumin, har lenge vært antatt å være forårsaket av forandringer i permeabilitet barriere består av podocytes, vaskulære endotelceller, og en basalmembran arbeider i samklang. Data fra vårt laboratorium ved hjelp intravital 2-foton mikroskopi avslørte en mer gjennomtrengelig glomerulær filtrering barriere (GFB) enn tidligere antatt i henhold fysiologiske forhold, med henting av filtrert albumin forekommer i en tidlig undergruppe av celler som kalles proksimale tubulære celler (PTC) ^{1,2, 3.}

Tidligere teknikker som brukes til å studere nyrefiltrasjon, etablere de karakteristiske for filtrerings-barriere involvert micropuncture av lumen av disse tidlige rørformede segmenter med prøvetaking av væskeinnhold og analyse ^4.. Disse studier fastslått albuminkonsentrasjon i den luminale væske for å være praktisk talt ikke-eksisterende, tilsvarende tettmed det som normalt detekteres i urinen. Avslørte imidlertid karakterisering av dekstran polymerer med definerte størrelser til denne teknikken de av en størrelse lik serumalbumin hadde høyere nivåer i den rørformede lumen og urin; tyder økt permeabilitet ^5..

Heri er en detaljert skisse av den teknikk som brukes til direkte å visualisere og kvantifisere glomerulær fluorescerende albumin permeabilitet in vivo. Denne metoden gjør det mulig for påvisning av filtrert albumin over filtrering barriere i Bowmans plass (den første kammer av urin filtrering), og også tillater kvantifisering av albumin reabsorpsjon av proksimale tubuli og visualisering av påfølgende albumin transcytosis ^seks. Fraværet av fluorescerende albumin sammen senere rørformede segmenter vei til blæren fremhever effektiviteten av henting veien i tidligere proksimale tubulære segmenter. Dessuten, når denne teknikken ble brukt bestemme permeabilitetav dextraner har en lignende størrelse til albumin nesten identiske permeabilitet verdier ble rapportert ^to. Disse observasjonene direkte støtter behovet for å utvide fokus for mange proteinuric nyresykdommer til inkluderte endringer i proksimale tubuli celle gjenvinning.

Protocol

1. Bøyning av Rat Serum Albumin til Sulfo-Rhodamine 101 sulfonyklorid (Texas Red) Oppløs 100 mg Rotte serumalbumin (RSA) i 6,667 ml av 100 mM natriumbikarbonat, pH 9,0, sluttkonsentrasjon 15 mg / ml i en 50 ml konisk rør. Sted oppløsning i is / vann begerglass og avkjøl til mellom 0-4 ° C. Tilsett 200 ul av høy kvalitet vannfritt dimetylformamid (DMF) til en 10 mg ampulle med Texas Red sulfonylklorid (TRSC); vortex på medium i 15 sek. Vortex RSA løsning på medium og til…

Representative Results

Figur 3 viser et eksempel på et bilde som er tatt fra en overflate av en glomerulus Munchen Frömter Wistar rotte og de ​​skritt som er tatt for å bestemme permeabiliteten av fluorescerende albumin. GSC verdi for albumin på 0,0111 avledet for denne personen glomerulus faller innenfor området sett i denne stamme av München Wistar rotter når i matet tilstand tre. Stabiliteten sett i dette bilde er på grunn av den nøye planlegging og utførelse av instruksjoner som er avbildet i <str…

Discussion

Trinnene uthevet her representerer hva vi føler for å være de som vil produsere konsistente og nøyaktige permeabilitet verdier fordi de omgå disse fallgruvene:

1. Spredning: Bruken av en rød emitting fluorophores rette for mer effektiv innsamling av lys siden lengre bølgelengde fotoner er mindre tilbøyelige til å spre seg. Ved hjelp av enten grønne eller blå emitting fluorophores vil innføre større variasjon i GSC er på grunn av økt variasjon i intensitet verdier fra kapillær looper og Bowman e…

Materials

Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07