قياس نفاذية كبيبي الجزيئات نيون باستخدام المجهر 2 فوتون في ميونيخ فئران ويستار
Summary
وهناك تقنية عالية الدقة باستخدام المجهر intavital 2 الفوتون لتصور مباشرة وتحديد الترشيح gloemrular في الكبيبات السطح. هذا الأسلوب يسمح للتقرير مباشرة من خصائص نفاذية الجزيئات في الدول على حد سواء طبيعية والمريضة.
Abstract
أمراض الكلى التي تنطوي على فقدان البول من الجزيئات الأساسية الكبيرة، مثل ألبومين المصل، منذ فترة طويلة يعتقد أن سببها تغييرات في حاجز نفاذية تتألف من podocytes، وخلايا بطانة الأوعية الدموية، والغشاء القاعدي تعمل في انسجام تام. وكشفت بيانات من مختبرنا باستخدام المجهر حيوي داخلي 2 الفوتون أكثر نفاذية كبيبي حاجز الترشيح (GFB) مما كان يعتقد سابقا في ظل ظروف الفسيولوجية، مع استرجاع تصفيتها الزلال التي تحدث في وقت مبكر فرعية من الخلايا تسمى الخلايا نبيب الداني (PTC) 1،2، 3.
التقنيات السابقة تستخدم لدراسة الترشيح الكلوي وإنشاء سمة من حاجز الترشيح تشارك بزل مجهري من تجويف أنبوبي هذه القطاعات في وقت مبكر مع عينة من المحتوى وتحليل السائل 4. تحدد هذه الدراسات تركيز الألبومين في السائل اللمعية أن تكون شبه معدومة؛ المقابلة عن كثبلماذا يتم الكشف عادة في البول. ومع ذلك، وتوصيف البوليمرات ديكستران مع الأحجام التي تحددها هذه التقنية كشفت تلك ذات حجم مماثل لألبومين المصل لديهم مستويات أعلى في التجويف الأنبوبي والبول؛ مما يوحي زيادة نفاذية 5.
وهنا هو مخطط تفصيلي للتقنية المستخدمة لتصور مباشرة وقياس نفاذية كبيبي الألبومين الفلورسنت في الجسم الحي. هذا الأسلوب يسمح للكشف عن ألبومين تصفيتها عبر حاجز الترشيح في الفضاء بومان (الغرفة الأولي من الترشيح البولية)، وأيضا يسمح الكمي لاستيعاب الزلال بواسطة الأنابيب القريبة والتخيل من transcytosis الزلال اللاحقة 6. غياب الفلورسنت الألبومين في وقت لاحق على طول قطاعات أنبوبي في طريقها إلى المثانة يسلط الضوء على كفاءة مسار استرجاع في قطاعات نبيب الداني في وقت سابق. وعلاوة على ذلك، عندما تم تطبيق هذه التقنية لتحديد نفاذيةمن تم الإبلاغ عن dextrans وجود حجم مماثل لالزلال القيم نفاذية مطابقة تقريبا 2. هذه الملاحظات دعم مباشرة على الحاجة إلى توسيع تركيز العديد من الأمراض الكلوية بروتيني البيلة إلى التعديلات المدرجة في القريب أنبوب صغير استصلاح الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تمثل الخطوات تسليط الضوء هنا ما نشعر به لتكون تلك التي من شأنها أن تنتج قيم نفاذية متسقة ودقيقة لأنها تحايل على المزالق التالية:
- نثر: إن استخدام fluorophores ينبعث منها الأحمر يسمح لجمع أكثر كفاءة من الضوء منذ الفوتونات ال?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكاترة سيلفيا B كامبوس Bilderback وجورج J رودس لاستكمال الإجراءات الجراحية التي تنطوي على وضع خطوط الوصول الوريدي. وهم يودون أيضا أن أشكر سارة E فطم عن الحفاظ على المستعمرات ميونيخ-يستار تتكون من كل من سيمونسن وسلالات Frömter.
Materials
| Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope | Olympus America | Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90 | |
| Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser | Spectra-Physics | Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm | |
| Gallium arsenide phosphide photodetectors | Hamamatsu Corp | Note: Front or Side mounted configurations available. | |
| Metamorph Image processing Software | Molecular Dynamics | Note: Version 6.1r1 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corportation | 2007 version | |
| Handling Forceps | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78266-04 | |
| Mayo Dissecting Scissors | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72962 | |
| CA Micro scissors Model 1C300 | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78180-1C3 | |
| Kelly Hemostatic Forceps (straight) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72930 | |
| Water Jacket Blanket + Heating Pad | Gaymar | T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC | |
| Repti-Therm Under Tank Heater | ZooMed | RH-4 | |
| Texas Red Sulfonyl Chloride | Invitrogen/Molecular Probes | Cat# T-353 | |
| Rat Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A-6272 | |
| High Quality Anhydrous DMF | Sigma Aldrich | Cat# 270547 | |
| Strate-Line Autoclave Tape | Fisher Scientific | Cat# 11-889-1 | |
| Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 70665-07 |
References
- Russo, L. M., et al. The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states. Kidney International. 71, 504 (2007).
- Russo, L. M., et al. Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489 (2009).
- Sandoval, R. M., et al. Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447 (2012).
- Tojo, A., Endou, H. Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique. American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).
- Asgeirsson, D., et al. Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation. Acta Physiologica. 191 (3), 237 (2007).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy. Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).
- Dunn, K. W., et al. Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).
