En teknik udnytter høj opløsning intavital 2-foton mikroskopi til direkte at visualisere og kvantificere gloemrular filtrering i overfladen glomeruli. Denne metode giver mulighed for direkte bestemmelse af permeabilitetsegenskaber af makromolekyler i både normale og syge tilstande.
Nyresygdomme involverer urin tab af store væsentlige makromolekyler, såsom serumalbumin, har længe været anset for at være forårsaget af ændringer i permeabiliteten barriere består af podocytes, vaskulære endotelceller, og en basalmembran arbejder i fællesskab. Data fra vores laboratorium ved hjælp intravital 2-foton mikroskopi afslørede en mere permeabel glomerulær filtration barriere (GFB) end tidligere antaget under fysiologiske betingelser, med genfinding af filtreret albumin forekommer i en tidlig delmængde af celler, der kaldes proximale tubuliceller (PTC) 1,2, 3..
Tidligere teknikker, der anvendes til at studere renal filtrering og oprettelse af karakteristisk for filtrering barriere involverede micropuncture af lumen af disse tidlige rørformede segmenter med prøveudtagning af væske indhold og analyse 4.. Disse undersøgelser fastlagt albumin koncentrationen i den luminale væske til at være næsten ikke-eksisterende, svarende nøjehvilket normalt påvises i urinen. Imidlertid karakterisering af dextran polymerer med definerede størrelser af denne teknik viste de en størrelse svarende til serumalbumin havde højere niveauer i den rørformede lumen og urin, hvilket tyder øget gennemtrængelighed 5..
Heri er en detaljeret skitse af teknik, der anvendes til direkte at visualisere og kvantificere glomerulær fluorescerende albumin permeabilitet in vivo. Denne metode giver mulighed for påvisning af filtreret albumin tværs filtrering barrieren til Bowmans rum (den oprindelige kammer urin filtrering), og også tillader kvantificering af albumin reabsorption af proximale tubuli og visualisering af efterfølgende albumin transcytose 6.. Fraværet af fluorescerende albumin langs senere rørformede segmenter undervejs til blæren fremhæver effektiviteten af hentning vej i de tidligere proksimale segmenter. Hertil kommer, at når denne teknik blev anvendt bestemme permeabilitetenaf dextraner med en lignende størrelse til albumin næsten ens permeabilitetsværdier blev rapporteret 2. Disse observationer er direkte støtter behovet for at udvide fokus for mange proteinuric nyresygdomme til omfattede ændringer i proksimal tubulus celle regenerering.
Trinene fremhævet her repræsenterer, hvad vi føler for at være dem, der vil producere konsistente og præcise permeabilitetsværdier fordi de omgå de følgende faldgruber:
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Drs Silvia B Campos-Bilderback og George J Rhodes til at udfylde kirurgiske procedurer, der involverer placering af venøse adgang linjer. De vil også gerne takke Sara E Wean for at opretholde München-Wistar kolonier bestående af både Simonsen og Frömter stammer.
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope | Olympus America | Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90 | |
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser | Spectra-Physics | Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm | |
Gallium arsenide phosphide photodetectors | Hamamatsu Corp | Note: Front or Side mounted configurations available. | |
Metamorph Image processing Software | Molecular Dynamics | Note: Version 6.1r1 | |
Microsoft Excel | Microsoft Corportation | 2007 version | |
Handling Forceps | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78266-04 | |
Mayo Dissecting Scissors | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72962 | |
CA Micro scissors Model 1C300 | Electron Microscopy Sciences | Cat# 78180-1C3 | |
Kelly Hemostatic Forceps (straight) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 72930 | |
Water Jacket Blanket + Heating Pad | Gaymar | T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC | |
Repti-Therm Under Tank Heater | ZooMed | RH-4 | |
Texas Red Sulfonyl Chloride | Invitrogen/Molecular Probes | Cat# T-353 | |
Rat Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A-6272 | |
High Quality Anhydrous DMF | Sigma Aldrich | Cat# 270547 | |
Strate-Line Autoclave Tape | Fisher Scientific | Cat# 11-889-1 | |
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) | Electron Microscopy Sciences | Cat# 70665-07 |