Kvantitativ hög kapacitet encelliga cytotoxicitetsanalys för T-celler

Summary

Vi beskriver en encellig hög genomströmning analys för att mäta cytotoxicitet hos T-celler när de inkuberas med tumörmålceller. Denna metod använder en tät, elastomer matris av sub-nanoliter brunnar (~ 100.000 brunnar / grupp) att rumsligt begränsa de T-celler och målceller vid definierade förhållanden och är kopplad till fluorescensmikroskopi för att övervaka effektor-mål konjugering och efterföljande apoptos.

Abstract

Cancer immunterapi kan utnyttja specificitet immunsvaret att rikta och eliminera tumörer. Adoptiv cellterapi (ACT) baserat på adoptiv överföring av T-celler genetiskt modifierade för att uttrycka en chimär antigenreceptor (CAR) har visat mycket lovande i kliniska prövningar ^1-4. Det finns flera fördelar med att använda CAR ⁺ T-celler för behandling av cancer, inklusive förmågan att rikta icke-MHC begränsade antigener och att funktionalisera de T-celler för optimal överlevnad, målsökande och uthållighet i värden, och slutligen för att inducera apoptos av CAR ⁺ T-celler i händelse av värdtoxicitet ^5.

Avgränsar de optimala funktioner CAR ⁺ T-celler associerade med klinisk nytta är avgörande för utformningen av nästa generation av kliniska prövningar. Senaste framstegen inom levande djur avbildning som multiphoton mikroskopi har revolutionerat studiet av immunceller funktion iN in vivo ^6,7. Även om dessa studier har avancerat vår förståelse av T-cellfunktioner in vivo, T-cell baserad ACT i kliniska prövningar kräver att behovet av att koppla molekylära och funktionella egenskaper hos T-cell preparat före infusion med klinisk effekt efter infusionen, genom att utnyttja i vitro-analyser övervakning T-cellfunktioner som, cytotoxicitet och cytokin sekretion. Standard flödescytometri baserade analyser har utvecklats som bestämmer den övergripande funktion av populationer av T-celler vid encelliga nivå men dessa är inte lämpliga för övervakning av konjugat-bildning och livslängd eller förmågan hos samma cell för att döda flera mål ^8.

Mikrofabricerade matriser utformade i biokompatibla polymerer som polydimetylsiloxan (PDMS) är en särskilt attraktiv metod för att rumsligt begränsa effektorer och mål i små volymer ^9. I kombination med automatiserad time-lapse fluorescensmikroskopi, thousands av effektor-mål interaktioner kan övervakas samtidigt av avbildning enskilda brunnar i en nanowell array. Vi presenterar här en hög genomströmning metod för övervakning av T-celler förmedlad cytotoxicitet vid encelliga nivå som kan tillämpas i stor utsträckning för att studera den cytolytiska funktionaliteten av T-celler.

Protocol

1. Reagens Förberedelser Framställ RPMI-PLGH genom blandning 500 ml RPMI-1640 och 5 ml vardera av penicillin-streptomycin, L-glutamin, och HEPES-lösning. Bered R10 lösning genom att blanda RPMI-PLGH med 10% fetalt bovint serum (FBS). FBS är värmeinaktiveras vid 56 ° C under 30 min före tillsats. Pre-varm vid 37 ° C 50 ml RPMI-PLGH, 15 PBS ml och 15 ml R10 i sterila koniska rör. Tillverkning av grupper av nanowells i PDMS: Kisel Master är tillverkad med fotolitografi v?…

Representative Results

Ett exempel på tillämpningen av hög genomströmning cytolytiska analysen visas i figur 2. Kortfattat, märkt CD19-specifika CAR + T-celler sam-inkuberas med märkt mus EL4 målceller i de enskilda brunnarna i en nanowell array (avsnitt 1-5). En första bild spelades in på automatiserade fluorescerande mikroskop för att identifiera beläggning (effektorer och / eller mål) för varje enskild nanowell på matrisen (avsnitt 6). Bildbehandling användes för att identifiera alla nanowells in…

Discussion

Vi har beskrivit protokollet för en hög genomströmning encelliga cytolytisk analys aktiveras via samtidig inkubation av effektorer och mål i grupper av nanowells (Figur 1). Förutom genomströmning en stor fördel med tekniken är möjligheten att övervaka effektor-medierad cytotoxicitet mot önskade målceller utan behov av målcellen teknik som i sin tur möjliggör användning av autologa eller matchade / primär tumörceller som målceller. Den rumsliga inneslutning tillåter hämtning och efte…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
RPMI-1640 w/o L-glutamine	Cellgro	15-040-CV
Penicillin-streptomycin	Cellgro	30-002-CI	10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin
L-glutamine	Cellgro	25-005-CI	200 mM solution
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1M
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	Lot tested
Cell Tracker Red Stain	Invitrogen	C34552	50 μg
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Invitrogen	V35003	5 mM
SYTOX green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 μl
Dulbecco’s PBS	Cellgro	21-031-CV	500 ml
Noble agar	DIFCO	2M220	100 g
Trypan Blue	Sigma Aldrich	T8154	0.4% liquid, sterile filtered
Hemocytometer	Hausser Scientifics	1492	Bright line
4-well plate	Thermo Fisher	167603
Harrick Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Basic plasma cleaner
Observer.Z1	ZEISS		Fluorescent microscope (works with the three parts below)
Lambda 10-3	Sutter Instrument		Filter controller
Lambda DG-4	Sutter Instrument		Ultra-High-Speed Wavelength switcher
Hamamatsu EM-CCD Camera	Hamamatsu	C9100-13	CCD-Microscope camera
15 ml conical tube	BD Falcon	352097
50 ml conical tube	VWR	3282-345-300
Nikon Biostation	Nikon Instruments Inc.	Biostation IM
Glass bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-0	35 mm petri dish, 10 mm microwell