Procédure de décellularisation de coeur de porc par perfusion coronaire rétrograde
Summary
Une méthode pour rapidement et complètement éliminer les composants cellulaires à partir d'un coeur de porc intacte grâce à une perfusion rétrograde est décrite. Cette méthode permet d'obtenir un site spécifique de la matrice extracellulaire cardiaque échafaudage qui a le potentiel pour être utilisé dans de multiples applications cliniques.
Abstract
Perfusion basée sur décellularisation organe entier a récemment suscité un intérêt dans le domaine du génie tissulaire comme un moyen de créer des sites spécifiques échafaudages de la matrice extracellulaire, bien que largement en préservant l'architecture d'origine de l'échafaud. À ce jour, cette approche a été utilisée dans une variété de systèmes d'organes, y compris le cœur, les poumons, le foie et 1-5. Décellularisation méthodes précédentes pour tissus sans un réseau facilement accessible vasculaire ont invoqué l'exposition prolongée des tissus à des solutions de détergents, acides ou les traitements enzymatiques comme un moyen d'éliminer les composants cellulaires et nucléaires de l'environnement extracellulaire 6-8. Cependant, l'efficacité de ces méthodes charnière sur la capacité des solutions à imprégner le tissu par diffusion. En revanche, la perfusion des organes à travers le système vasculaire naturel pour effet de réduire la distance de diffusion et de transport facilité de decellularizatides agents dans le tissu et les composants cellulaires sur le tissu. Nous décrivons ici une méthode pour bien decellularize un coeur de porc intacte grâce à une perfusion rétrograde coronaire. Le protocole donné entièrement décellularisé cardiaque matrice extracellulaire (ECM-c) d'échafaudage avec la structure tridimensionnelle du coeur intact. Notre procédé utilisé une série d'enzymes, les détergents, les acides et les produits de rinçage couplé avec hypertoniques et hypotoniques pour aider à la lyse et l'élimination des cellules. Le protocole utilisé une solution de Trypsine pour détacher les cellules de la matrice, suivie par des solutions de Triton X-100 désoxycholate de sodium et d'aider à l'élimination de la matière cellulaire. Le protocole décrit utilise également des vitesses de perfusion de plus de 2 L / min pour des périodes de temps prolongées. La vitesse d'écoulement élevée, associée à des changements souhaités solution transport d'agents dans le tissu sans contamination des débris cellulaires et assurer un rinçage efficace du tissu. La méthode décrite enlevé toutes les matières nucléaires de native porcine tissu cardiaque, la création d'un site spécifique cardiaque ECM échafaudage qui peut être utilisé pour une variété d'applications.
Protocol
Representative Results
Discussion
La présente étude décrit la méthodologie pour décellularisation cohérente et efficace d'un coeur de porc. Le protocole a été une modification à un rapport déjà publié 1, et comprenait une exposition plus longue à l'écoulement et de la pression accrue, ce qui a donné des résultats plus reproductibles. Le tissu résultant décellularisé satisfait à tous les critères publiés pour décellularisation réussie de tissu 2. Changements fréquents de solution ont été réalisée…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Brogan Invité, Michelle Weaver, et Kristen Lippert. Le financement de cette étude a été fourni par des subventions du NIH R03EB009237, ainsi que les subventions de formation NIH T32EB001026-06 de l'Institut national d'imagerie biomédicale et de la bioingénierie et T32HL076124-05.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
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