تعديل وإعادة التركيب الوراثي للاللعابية الثقافات الجهاز الغدة

Summary

وهناك تقنية لمعالجة وراثيا داخل الخلايا الظهارية كله<em> خارج الجسم</emيوصف> الجنينية الماوس مثقف الغدد تحت الفك السفلي (SMGs) باستخدام نقل الجينات الفيروسية. هذه الطريقة يستفيد من قدرة فطرية من SMG ظهارة واللحمة المتوسطة لإعادة تجميع تلقائيا بعد الانفصال وإصابة اساسيات الظهارية مع ناقلات الغدانية.

Abstract

المتفرعة التشكل يحدث خلال تطوير العديد من الأجهزة، وتحت الفك السفلي الماوس الجنينية الغدة (SMG) هو النموذج الكلاسيكي لدراسة التشكل المتفرعة. في SMG النامية، وهذه العملية تنطوي على خطوات متكررة من برعم الظهارية وتشكيل لاصق، لإعطاء نهاية المطاف إلى نشوء شبكة متفرعة معقدة من القنوات وعنيبات، التي تعمل على إنتاج وتعديل / نقل اللعاب، على التوالي، في تجويف الفم ^{1 – 3.} الغشاء القاعدي الظهارية المرتبطة وجوانب المقصورة الوسيطة، بما في ذلك خلايا اللحمة المتوسطة، وعوامل النمو المصفوفة خارج الخلية، التي تنتجها هذه الخلايا، حاسمة بالنسبة لآلية المتفرعة، على الرغم من كيفية تنسيق الأحداث الخلوية والجزيئية تبقى غير مفهومة ⁴ . دراسة الآليات الجزيئية القيادة السلف التشكل الظهارية فهمنا لآليات التنموية ورؤية ثاقبة regener ممكننهج الطب اطر النسبية. وتعطلت مثل هذه الدراسات نظرا لعدم وجود طرق فعالة للتلاعب الجيني للظهارة اللعابية. حاليا، يمثل تنبيغ الغدانية الأسلوب الأكثر فعالية لاستهداف الخلايا الظهارية في الغدد في الجسم الحي الكبار ^5. ومع ذلك، في إإكسبلنتس الجنينية، اللحمة المتوسطة كثيفة والغشاء القاعدي الخلايا الظهارية المحيطة يعوق الوصول الفيروسية للخلايا الظهارية. إذا تمت إزالة اللحمة المتوسطة، يمكن تقاس باستخدام الظهارة الفيروسات الغدية، واساسيات الظهارية يمكن استئناف المتفرعة التشكل في وجود أو Matrigel laminin 111 ^6،7. اللحمة المتوسطة خالية النمو رديم الظهارية يتطلب أيضا مكملات إضافية مع عوامل النمو للذوبان ولا ألخص بشكل كامل التشكل المتفرعة كما يحدث في الغدد سليمة ^8. نحن هنا وصف الأسلوب الذي يسهل تنبيغ الغدانية من الخلايا الظهارية وثقافة بالنقل هpithelium مع اللحمة المتوسطة المرتبطة بها. بعد تسليخ مجهري للSMGs الجنينية، إزالة اللحمة المتوسطة، والعدوى الفيروسية من ظهارة مع اتش GFP التي تحتوي على، وتبين لنا أن يعيد توحيد ظهارة تلقائيا، مع اللحمة المتوسطة غير مصاب، تلخص سليمة هيكل غدي SMG والمتفرعة التشكل. ويمكن للسكان المعدلة وراثيا الخلايا الظهارية رصدها بسهولة باستخدام معيار أساليب مضان المجهري، إذا fluorescently-الموسومة تستخدم بنيات الغدانية. طريقة إعادة التركيب الأنسجة الموصوفة هنا هو حاليا الأسلوب الأكثر فعالية ويمكن الوصول إليها عن ترنسفكأيشن من الخلايا الظهارية مع ناقل البرية من نوع أو متحولة ضمن بناء الأنسجة 3D المعقدة التي لا تتطلب جيل من الحيوانات المعدلة وراثيا.

Protocol

ويتضمن البروتوكول أربع خطوات رئيسية، كما هو مبين في الشكل 1. يتم وصف كل الخطوات بالتفصيل الكامل. يجب أن يتم تنفيذ البناء وتنقية الفيروسية اتش في وقت سابق للحصاد الجهاز للاستخدام في تنبيغ الوراثية من اساسيات تشريح الظهارية. يجب اتباع جميع احتياطات السلامة ال?…

Representative Results

ويرد تدفق الخطوات التجريبية الرئيسية في الشكل 1. وتظهر مثال لSMG سليمة، وهي معزولة رديم الظهارية، واللحمة المتوسطة المناظر له في الشكل 2. صور من Brightfield SMGs معاد، التي لا تزال تخضع المتفرعة التشكل عندما تظهر مثقف فيفو السابقين لصحيفة المشار إليها، …

Discussion

نشرت لأول مرة خارج الجسم تقنية إعادة التركيب الظهارية الوسيطة-الغدد اللعابية تحت الفك السفلي لعام 1981 ^16. في هذا البروتوكول، ونحن على توسيع الأسلوب الأصلي، وذلك باستخدام عدوى الفيروسة الغدانية للتلاعب الظهارية التعبير الجيني الخلية في سياق غدة معاد. علينا …

Materials

Name of the Reagent	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/Ham’s F12 Medium without phenol red	Life Technologies	21041-025
Penicillin and Streptomycin	Life Technologies	15070-163	10X stock
Dispase	Life Technologies	17105-041	Freeze single use aliquots at -20C
BSA	Sigma	A2934-100G	Fraction V, low endotoxin
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	Should be high titer (1×1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay.
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v)
1X Phosphate-buffered saline (PBS)	Life Technologies	70011-044	Prepared from 10X stock
Hank’s Balanced Salt Solution	Life Technologies	14175095	no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red
Transferrin	Sigma	T8158	25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C
L- Ascorbic acid (Vitamin C)	Sigma	A4403	75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C
			Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol.
10 cm sterile plastic dishes	Corning	430167	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo dissecting microscope with transmitted light base	Nikon	SMZ645	Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
35 mm tissue culture dishes	Falcon	353001	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50 mm diameter microwell dishes	MatTek Corporation	P50-G-1.5-14F
Nuclepore Track-Etch membrane filters	Whatman	110405	13 mm diameter, 0.1 mm pore size
Widefield fluorescence microscope	Carl Zeiss, USA	Axio Observer Z1	Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SP5	Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR	Charles River Labs		Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0).
Scalpel blade #11	Fine Science Tools	10011-00
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	10003-12
Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm	Fine Science Tools	11252-20	Ideal for harvesting glands from embryos
Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm	Fine Science Tools	11295-20	Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
			Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol.