Isolasjon og kultur myofibers er gullstandarden<em> In vitro</em> For å studere overgangen til satellitt celler gjennom quiescence, aktivering og differensiering. Viktigere, bevarer den eneste myofiber kultur systemet myofiber / stamcelleforskningen forening, som er en viktig del av muskel stamceller nisje.
Muskelregenerasjonenen i voksen er utført av fastboende stamceller kalt satellitt celler. Satellitt celler er definert av sin posisjon mellom basal lamina og sarcolemma av hver myofiber. Dagens kunnskap om deres atferd er sterkt avhengig av bruken av singelen myofiber isolasjon protokollen. I 1985 beskrev Bischoff en protokoll for å isolere én levende fibre fra Flexor digitorum Brevis (FDB) av voksne rotter med det mål å skape et in vitro system der den fysiske tilknytningen mellom myofiber og dets stamceller er bevart en. I 1995 Rosenblattmodified den Bischoff protokollen slik at myofibers er enkeltvis plukket og håndtert separat etter collagenase fordøyelsen stedet for å bli isolert av tyngdekraften sedimentering 2, 3. Den Rosenblatt eller Bischoff protokollen har siden blitt tilpasset ulike muskler, alder eller forhold 3-6. Singelen myofiber isolasjon teknikk er en uunnværligverktøy på grunn av sin unike fordeler. Først i den ene myofiber protokollen, er satellitt celler opprettholdes under basal lamina. Dette er en unik funksjon av protokollen som andre teknikker som Fluorescence Aktivert Cell Sortering krever kjemisk og mekanisk vev dissosiasjon 7. Selv om myofiber kultur systemet ikke kan erstatte in vivo studier, det tilbyr en utmerket plattform for å løse relevante biologiske egenskaper av muskel stamceller. Enkelt myofibers kan dyrkes i standard plating forhold eller i flytende forhold. Satellitt celler på flytende myofibers er utsatt for nesten ingen annen innflytelse enn myofiber miljøet. Substrat stivhet og belegg har vist seg å påvirke satellitt cellenes evne til å regenerere muskler 8, 9 så å kunne kontrollere hver av disse faktorene tillater uavhengig diskriminering mellom nisje-avhengig og-uavhengige responser. Ulike konsentrasjoner av serum harogså vist seg å ha en effekt på overgangen fra quiescence til aktivering. Å bevare quiescence tilstanden av dens tilknyttede satellitt celler, bør fibrene holdes i lav serummedium 1-3. Dette er spesielt nyttig når man vil studere gener involvert i quiescence staten. I serum rik medium, satellitt celler raskt aktivere, spre seg, migrere og skille, og dermed etterligne in vivo regenerativ prosess 1-3. Systemet kan brukes til å utføre en rekke analyser som testing av kjemiske inhibitorer; ektopisk ekspresjon av gener ved virus produksjonstid; oligonukleotid basert genet knock-ned eller direkte avbildning. Denne videoen artikkelen beskriver protokollen som nå brukes i vårt laboratorium for å isolere én myofibers fra extensor digitorum longus (EDL) muskel av voksne mus (6-8 uker gamle).
Isolering og kultur av enkelt myofibers fra intakte muskler gir en utmerket in vitro modell for å studere prosessen muskelregenerasjonenen. En unik funksjon i dette systemet er bevaring av satellitten celler i deres fysiologiske miljø under basal lamina. Viktigst, kan teknikken brukes til å undersøke muskel stamcelleforskningen atferd både quiescence og aktiverte stater. I løpet av de siste 20 årene har myofiber kultur systemet er levert meningsfulle innsikt i biologi satellitt cellepopulasjon både med hensyn til indre og ytre faktorer. Ved dyrking individuelle myofibers har satellitt celle heterogenitet med hensyn til myofiber, muskel type eller regenerativ potensial blitt adressert 15. Forseggjort studier med direkte avbildning av enkle dyrkede fibre tillatt for å få informasjon om satellitt celle vandringsmønster 16. Kjøpet av kvantitative data er enLSO er mulig. Selv tidkrevende, gir det vesentlig informasjon om utbredelse og forekomst av spesifikke hendelser (stamceller asymmetrisk divisjon, spredning og differensiering ratio, etc.). Sammen med tidligere beskrevne anvendelser, er protein eller RNA ekstraksjon fra enkle fibre også mulig, selv om isolasjon av ren populasjon av satellitten celler etter FACS eller andre midler kan gi en bedre plattform å undersøke protein eller genekspresjon endringer på et molekylært nivå. I vår erfaring, er det mest kritiske trinnet for vellykket fiber isolert "sene til sene" isolasjon (trinn 2.5 til 2.9 i protokollen tekst). Dette garanterer at etter muskel fordøyelsen, er fiber frigjøres fra EDL med minimal eller ingen skade og dermed øke sine resultater i de neste trinnene.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Sarah Dick for å gi kritisk lesing og kommentarer. MAR holder Canada Research Chair i molekylær genetikk, og er en International Research Scholar av Howard Hughes Medical Institute. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til MAR fra National Institutes of Health, Howard Hughes Medical Institute, den kanadiske Institutes of Health Research, muskeldystrofi Association og Canada Research Chair Program.
Reagent/Material | |||
Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130-1g | Prepare fresh all times for optimal results. Additional aliquots of undiluted collagenase can be stored at -20 °C. |
DMEM High Glucose + NaPyr | Invitrogen | 11995073 | Addition of Pen/Strep is necessary to minimize air contaminations |
Characterized Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | Lot #KUJ35152 |
Horse Serum | Hyclone | SH300.74.03 | Lot #AVJ82494 |
Chicken Embryo Extract | Accurate Chemical | CE-650-T, Batch B7035010 | Avoid freezing-thawing cycles. |
Matrigel | BD | Store aliquots at -20 °C. Avoid freezing-thawing cycles. Store diluted aliquots at 4 °C. | |
Equipment | |||
Cohann-Vannas Spring Scissor 6mm Blades-Straight-Sharp | Fine Science Tools | 15000-02 | |
Extra Thin Iris Scissors- 10.5cm | Fine Science Tools | 14088-10 | |
Moria-Iris Forceps Curved | Fine Science Tools | 11373-12 | |
Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | 14672-200 |
Diamond Pen | VWR | 52865-005 | |
60*15mm Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
Acrodisc 0.22 μm Filter | VWR | CA28-145-477 | |
Dissecting Microscope StemiV6 | Zeiss | An additional light source may be required to have a better focus view |