Generación y Recuperación de β-células esferoides de PEG-péptido de crecimiento Paso hidrogeles
Summary
El siguiente protocolo proporciona técnicas para encapsular las células β del páncreas en PEG-péptido crecimiento paso a hidrogeles formados por tiol-eno clic en la foto-reacciones. Esta plataforma de material no sólo ofrece un microambiente citocompatible para encapsulación de células, sino que permite también controlada por el usuario rápida recuperación de las estructuras celulares formadas dentro de los hidrogeles.
Abstract
Los hidrogeles son polímeros reticulados hidrófilos que proporcionan un microentorno tridimensional con tejido-como elasticidad y alta permeabilidad para el cultivo de células o tejidos terapéuticamente relevantes. Los hidrogeles preparados a partir de poli (etilenglicol) (PEG) derivados se utilizan cada vez más para una variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos, en parte debido a sus propiedades sintonizables y citocompatible. En este protocolo, se utilizó tiol-eno de crecimiento paso a photopolymerizations para fabricar PEG-péptido hidrogeles para encapsular pancreático MIN6 células b. Los geles fueron formados por PEG-norborneno 4-brazo (PEG4NB) macrómero y un agente de reticulación péptido con quimotripsina sensible (CGGYC). La naturaleza hidrófila y no la formación de incrustaciones de PEG ofrece un microambiente citocompatible para la supervivencia y la proliferación celular en 3D, mientras que el uso de la secuencia del péptido con quimotripsina sensible (C GGY ↓ C, flecha indica el sitio de escisión de enzima, mientras que el quiste terminalesresiduos eine se añadieron para tiol-eno reticulación) permite una rápida recuperación de los constructos de células que forman dentro del hidrogel. El siguiente protocolo elabora técnicas para: (1) La encapsulación de MIN6 β-células en tiol-eno hidrogeles, (2) ensayos de células cualitativos y cuantitativos de viabilidad para determinar la supervivencia y la proliferación celular; (3) Recuperación de esferoides de células usando quimotripsina mediada gel erosión, y (4) Análisis estructural y funcional de los esferoides recuperados.
Introduction
Los hidrogeles son polímeros hidrófilos reticulados con un potencial excepcional como los materiales del armazón para tejidos reparación y regeneración. 1-3 El alto contenido de agua de los hidrogeles permite la fácil difusión de oxígeno y el intercambio de nutrientes y productos metabólicos celulares, todas las cuales son cruciales para mantener la viabilidad celular. Además, los hidrogeles son excelentes portadores para la liberación controlada y suministro de células debido a su alta capacidad de ajuste. 2 hidrogeles sintéticos tales como los preparados a partir de poli (etilenglicol) (PEG) se utiliza cada vez más en aplicaciones de ingeniería de tejidos, en gran parte debido a su cytocompatibility, tejido- como elasticidad, y capacidad de sintonización de alta en el material de propiedades físicas y mecánicas. 4-6
Aunque una plataforma de hidrogel de uso común, los estudios han demostrado que el PEG diacrilato (PEGDA) hidrogeles formados por photopolymerizations crecimiento de cadena tienen una tendencia a dañar las células encapsuladas during reticulación de la red y en la encapsulación de células in situ. 7 El daño celular se atribuyó en gran medida a las especies de radicales generados por las moléculas de fotoiniciador, que se propagan a través de los grupos vinilo sobre PEGDA para reticular las cadenas de polímero en hidrogeles. Desafortunadamente, estas especies de radicales también causar tensiones y daño celular durante la encapsulación de células, especialmente para las células sensibles a radicales tales como el de páncreas β-células. 8-10 Con el fin de obtener un tamaño de malla más alta para una mejor difusión y la supervivencia celular, pesos moleculares más altos PEGDA se utilizan a menudo para la encapsulación de células. Esto, sin embargo, compromete la cinética de polimerización y causa sub-óptimas propiedades de gel biofísicos. 7,11,12 Además de las desventajas anteriormente mencionadas, es muy difícil de recuperar las estructuras celulares a partir de hidrogeles PEGDA debido a la naturaleza heterogeneidad y no degradable de las redes reticuladas. Mientras sensibles a la proteasa péptidos pueden ser incorporadosen esqueleto de PEG macrómero para hacer que los hidrogeles PEGDA otra parte inertes sensibles a la escisión enzimática, la conjugación a menudo usa reactivos caros y las redes resultantes contienen todavía alto grado de heterogeneidad debido a la naturaleza de la polimerización de crecimiento de cadena. 13-15
Recientemente, PEG-péptido hidrogeles formados a través de tiol-eno por crecimiento en etapas de fotopolimerización se ha demostrado que exhiben propiedades preferentes para la encapsulación de células a través de los hidrogeles formados por fotopolimerización crecimiento de cadena. 7 La cinética de gelificación superiores de tiol-eno hidrogeles se atribuye al clic " "la naturaleza de la reacción entre tiol y funcionalidades ENE. En comparación con la polimerización de crecimiento de cadena PEGDA, tiol-eno de reacción es menor de oxígeno inhibe la que los resultados de la tasa de gelificación más rápido. 16,17 tiol-eno hidrogeles también tienen una mayor eficiencia de polimerización y mejores propiedades biofísicas de gel en comparación con PEGDA crecimiento de cadena hidrogeles, 7 , 18 </ Sup>, que se traduce en un daño limitado celular causada por especies de radicales durante la fotopolimerización.
Anteriormente, tiol-eno hidrogeles formados por PEG-norborneno 4-brazo (PEG4NB) macrómero y bis-cisteína que contienen reticulantes de péptidos, tales como péptidos sensibles a proteasa se han utilizado para encapsulación de células. 7,18 tunability alta de las redes de hidrogel de PEG ofrece una microambiente 3D flexible y controlable para investigar la supervivencia celular y la actividad, mientras que el uso de proteasa sensible a la secuencia del péptido proporciona una manera suave para la recuperación de las construcciones de células formadas naturalmente dentro de los hidrogeles. En este protocolo, se utilizan por crecimiento en etapas fotopolimerizado tiol-eno hidrogeles fabricados usando 4-brazo PEG-norborneno (PEG4NB) y un agente de reticulación péptido con quimotripsina sensible (CGGY ↓ C) para la encapsulación de las células MIN6 β. Este protocolo sistemáticamente elabora técnicas para el estudio de la formación de la supervivencia, proliferación y esferoide de MIN6β-células en tiol-eno hidrogeles. Además proveímos método para la recuperación de las células β esferoide y caracterización biológica de los esferoides recuperados.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito presenta detalles sobre la encapsulación fácil de células en tiol-eno hidrogeles formados por fotopolimerización por crecimiento en etapas. Mientras que una relación estequiométrica de 1:1 de norborneno de grupos funcionales tiol se utilizó en este protocolo, la relación puede ser ajustada dependiendo de los experimentos. Además de una formulación correcta, es importante para mantener la homogeneidad en la solución de pre-polímero. En particular, el uso pipeteo suave para asegurar que l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue financiado por el NIH (R21EB013717) y IUPUI OVCR (RSFG). El autor agradece a la Sra. Han Tzu por su asistencia técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
| Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
| AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml disposable syringe | BD biosciences |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
- Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
- Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
- Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
- Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
- Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5′-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
- Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
- Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
- Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
- Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
- Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
- Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
- Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
