세포 생존 능력은 단백질 misfolding의 적시에 효율적 관리에 따라 달라집니다. 흠의 refolding, 열화, 또는 격리 : 우리는 여기 misfolded 단백질의 다른 잠재적 인 운명을 시각화하는 방법을 설명합니다. 우리는 Ubc9, 접이식 센서의 사용을 보여줍니다<sup> TS</sup>, 모니터링 proteostasis와 4D의 현미경을 사용하여 라이브 셀의 집계 품질 관리를위한.
모든 살아있는 세포의 주요 작업 중 하나는 끊임없이 변화하는 환경 조건과 세포 내 환경을 단단히 포장되어, 끈적하고, 단백질의 안정성 1 위험한의 얼굴에서 새롭게 합성 단백질의 적절한 접는을 유지하고 있습니다. 동적으로 단백질 생산, 접이식 및 저하의 균형을 할 수있는 능력이 누구의 절대 필요성 때 오작동 가장 관찰이 높은 전문 품질 관리 기계를 요구합니다. 이러한 ALS, 알츠하이머, 파킨슨, 그리고 낭포 성 섬유증의 특정 형태의 질병은 단백질 폴딩 품질 관리 구성 요소 2에 대한 직접 링크를 가지고 있고, 따라서 향후 치료 개발 기본 과정의 기본적인 이해를 필요로합니다. 우리 실험 과제는 세포가 손상 신호를 통합하고 다양한 상황에 맞게 조정됩니다 답변을 마운트 방법을 이해하는 것입니다.
단백질 misfolding은 실존 thre를 나타냅니다 왜 주된 이유셀에서 총에 잘못 접 단백질의 성향에 따라서 혼잡하고 섬세 세포 접이식 환경 (1)의 글로벌 섭동의 원인입니다. 접는 건강, 세포 프로테옴의 "proteostasis은"정교한 품질 관리 시스템 3,4에서 다른 기계론의 단위의 조율 된 행동에 의해, 심지어 노화, 스트레스와 산화 손상의 협박, 유지됩니다. 분자 보호자의 전문 기계가 아닌 기본 polypeptides을 구속하고 기본 상태 1로 자신의 접이식를 홍보 할 수 있습니다, ubiquitin-proteasome 시스템 (5)에 의해 저하 위해 타겟팅, 또는 보호 집계 함유 6-9로 안내.
juxtanuclear 품질 관리 구획 (JUNQ)과 불용성 단백질 보증금 (아이팟) (- 모델 그림 1) : eukaryotes에서 cytosolic 집계 품질 관리 하중은 두 개의 구획 8-10 사이에 분할됩니다.단백질 접힘 품질 관리 기계에 의해 ubiquitinated 아르 단백질들은이 proteasome에 의해 저하에 대한 처리 JUNQ에 전달됩니다. ubiquitinated되지 Misfolded 단백질들은 적극적으로 보호 구획에 집계됩니다 아이팟에 우회하고 있습니다.
최대이 시점까지, 라이브 세포 형광 현미경의 방법 론적 패러다임은 주로 라벨 단백질로 된 두 개의 차원에 시간 포인트와 보통 특정의 셀에 자신의 위치를 추적 할 수 있습니다. 새로운 기술은 살아있는 세포에 experimenters에게 submicron 규모에 전례없는 액세스 권한을 부여 할 시작으로, 세포 기질의 동적 아키텍처는 실험 특성에 대한 도전 뉴 프런티어로보기에왔다. 우리는 빠른 속도로 시간이 지남에 따라 효모 세포 기질에 여러 휘황 표시된 단백질의 3D 공간 배포판을 모니터링하기위한 방법을 제시한다. 3D timelapse (4D 영상)는 단순히 기술적 인 도전이다; 쥐그녀 또한 세포 구조를 분석하는 데 사용되는 개념적 프레임 워크에 극적인 변화를 용이하게한다.
우리는 빠른 4D 형광 이미징을 사용하여 세포 집계 품질 관리에 misfolded 단백질의 고유 한 운명을 시각화하는 라이브 효모에서 cytosolic 접이식 센서 단백질을 사용합니다. Ubc9 단백질 10-12 (Ubc9 TS)의 온도에 민감한 돌연변이 세포 proteostasis의 센서, 및 추적 집계 품질 관리에 대한 생리 학적 모델을 둘 다 매우 효과적입니다. 대부분의 TS 단백질과 마찬가지로, Ubc9 TS가 활성화 세포 보호자에 의해 허용 온도에서 완전히 접힌과 기능입니다. 30 위 ° C, 또는 셀 misfolding 스트레스, Ubc9 TS의 misfolds을 향해 있으며 돌연변이, 열 변성, 또는 산화 손상으로 인해 misfolded 된 기본 구상 단백질의 운명을 다음과 때. 그 스트레스 Foci을 형성하거나, 그대로 융합하여 GFP 또는 기타 fluorophores에는,이 3D로 추적 할 수 있습니다 디JUNQ 또는 iPod에 rected.
생화학 프로세스에 대한 우리의 직관이 반응물 및 제품의 잘 혼합 솔루션 비커에 평형에 도달 할 수되는 벤치 탑 실험에서 도출. 이러한 설정에서 특정 화학 종의 농도는 매크로 볼륨 분자의 몰 수량의 비율 인 하나의 숫자로 표현 될 수 있습니다. 세포의 전체 인구의 homogenates에서 추출을 수행 서부 blots, centrifugations, 그리고 분광 측정 : 많은 우리가 단백질 구조와 기능에 대해 알고 무엇의 고전, 대량 반응 사진을 반영 방법을 사용하여에서 유래.
우리가 배율에 따라 세포를보고 사용하는 기술로 도약하고 경계에 의해 향상은 대부분의 생화학 반응이 생체에서 개최되는 조건이 고전 벤치 탑 시나리오의 사람들 만이 조금 닮았 그런 적 명확하게된다. 뿐만 아니라 cel의 내부입니다라는 밀도가 크롤링 효과가 실질적으로 다양한 반응물의 활동을 변경하는, 또한 잘 혼합의 정반대이며, 환경을 포장. 체외의 복잡한 macromolecular 반응 폭 넓은 범위의 생체 효율성의 사이에 자주 차이에 대한이 차지한다.
아무데도 생체 폴딩, misfolding, 그리고 단백질의 집계에 관련된 질문에서와 같이 오해를 더 쉬운 체외 생화학 실험 클래식에서 형태소 분석 직관이 없습니다. 대량 반응 단백질 화학의 연구 간단한 예, 아니오로 답하는 등의 특정 단백질에 대한 개고의 문제를 처리 할 수 있습니다 반면, 라이브 셀에 고분자 전체 인구의 역학을 추적 할 시도가 가능한 전체 배포에 민감해야합니다 폴리펩티드 사슬을 사용할 수 conformational 결과와 misfolding 및 집계의 위험에 특히. 예를 들어, 우리는 대량 셀 리를 검사 할 수서쪽은 blotting하여 집계 단백질 물리게하다, 그리고 단백질이 대부분 불용성 및 ubiquitinated 아니라는 것을 확인하십시오. 그러나, 생활 셀에 여러 셀을 통해 평균 때를 검출하기 어려운, 단백질의 하위 인구 이산, 가용성 및 종의 로컬 농도가 매우 높은 특정 구획에 ubiquitinated 수 있습니다. 후자의 시나리오는 큰 대량 하위 인구보다 세포의 생존에 대한 더 많은 중요한 결과가 초래 될 수 있습니다. 보호자가 pleiotropic 행동과 체외에서 기능을 다양하게 표시 반면 또한,이 셀에 자신의 분리 기능이 spatially과 시간적으로 국한하는 증거가되고있다.
생화학을 이해 새롭게 새로운 패러다임에서, 농도는 세포의 나노 환경 각각의 변수 재산되고, 생물학적 과정을 기초 분자 이벤트뿐만 아니라 시간에 assayed해야합니다뿐만 아니라, spac에5. 여기에 제시된 4D 영상 방식은 다른 생물학적 과정의 수를 연구하는 데 사용할 수있는 방법과 그들이 시간, 공간에 규제 있지만, 라이브 셀의 단백질 misfolding의 민감한 모델링을 가능하게하고, 환경 조건의 변화에 따라. 이 논문에서 우리는 효과적으로 세포 기질의 단백질 응집체의 발병에 대처하는 단계와 옵션을 보여줍니다 Ubc9 TS 접는 센서를 사용합니다. 집계 품질 관리의 세포 생물학을 도시뿐만 아니라, 이러한 방식은, proteostasis (예를 들어 Ubc9 TS는 산화에 대한 응답으로 단백질 접힘 스트레스를 측정하는 데 사용할 수 있습니다에서 특정 섭동 또는 유전자 변이의 영향을 파악하기위한 강력한 도구로 제공 할 수 품질 관리 경로에서 유독 집계, 또는 변이)의 표현.
4D 영상을 정확하게 두 개의 서로 다른 단백질 간의 단백질 현지화 또는 colocalization를 결정하는도 중요합니다초, 그리고 어쩌면 과도하지만 중요 현상을 검출하기위한. 예를 들어, 특히 효모와 같은 작은 구형 유기체으로는, 4D 영상이 단순히 검사의 각도의 유물입니다 나타날 수 있습니다 반면 구조 또는 누계는 juxtanuclear 현지화을 가지고있는 경우로 나타날 수 있습니다.
우리가 여기에 제시 예를 들어 실험에서, 우리는 모델의 사용은 세포 기질의 시간과 공간에 대한 집계 품질 관리를 수행하는 단백질, Ubc9 TS를 misfolded 보여줍니다. 허용 온도에서 Ubc9 TS 가운은 개 어져 있으며, 핵 및 세포 기질에 확산. 열 유도 misfolding하면, 그것은 처음에 빠르게 proteasomal 저하에 처리됩니다 diffusing 작은 집계 스트레스 Foci을 형성한다. proteasome가 부분적으로 억제 될 때, 이러한 스트레스 Foci는 약 2 시간에 걸쳐 JUNQ 및 iPod 함유로 변환됩니다. ubiquitin로 인한 오염은 품질 관리 옵션, UB 등을 사용할 수없는 경우C9 TS는 즉시 보호 집계에 아이팟 포함에 다시 라우팅됩니다. 이 도구는 집계 품질 관리에 관련된 소설 유전 요인을 발견하고, 세포에서의 공간과 시간적 규정을 둘러 놀라운 기회를 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
MG132 | Mercury | mbs474790 | |
con A | Sigma | C2010 | |
Glass bottom plates | ibidi | ibd81158 | |
4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60X water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software. |