Préparation de la tumeur cellules dendritiques matures antigène chargées pour l'immunothérapie

Résumé

La méthode la plus couramment utilisée pour générer un grand nombre de cellules dendritiques autologues (CD) pour l'utilisation dans l'immunothérapie tumorale est décrite. La méthode utilise IL-4 et GM-CSF pour différencier les PED à partir de monocytes. Les DC immatures sont stimulées à maturité, puis chargé avec des antigènes avant qu'ils ne soient réinjectées au patient.

Résumé

Bien que des études cliniques ont établi que les vaccins DC antigène chargées sont sûrs et thérapie prometteuse pour les tumeurs ^1, leur efficacité clinique reste à établir. La méthode décrite ci-dessous, préparé conformément aux bonnes processus de fabrication (BPF) des lignes directrices, est une optimisation de la méthode de préparation ex vivo la plus courante pour générer un grand nombre de pays en développement pour les essais cliniques ^2.

Notre méthode utilise le TLR synthétique 3 agoniste POLYINOSINIQUE-polycytidylique Carboxymethylcellulose acide poly-L-lysine (Poly-ICLC) afin de stimuler les PED. Notre précédente étude a établi que Poly-ICLC est le stimulus de maturation individuelle la plus puissante pour les PED humains telle qu'elle est évaluée par une régulation positive de CD83 et CD86, l'induction de l'interleukine-12 (IL-12), le facteur de nécrose tumorale (TNF), l'interféron gamma induite Protéines 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), et interférons de type I (IFN) et l'interleukine minimal 10 (IL-10) de production. PED sont différenciées à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (CMSP surgelés) obtenues par cytaphérèse. PBMC sont isolées par gradient de Ficoll centrifugation et congelées en portions. Le Jour 1, CMSP sont décongelés et étalées sur des flacons de culture de tissus à choisir pour les monocytes qui adhèrent à la surface du plastique après 1-2 heures d'incubation à 37 ° C dans l'incubateur de culture tissulaire. Après incubation, les lymphocytes sont lavés et les monocytes adhérents sont cultivées pendant 5 jours en présence d'interleukine 4 (IL-4) et granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) se différencier pour les CD immatures. Au jour 6, DC immatures sont puisées avec la patelle protéines trou de serrure (KLH), qui sert de contrôle pour la qualité du vaccin et peut stimuler l'immunogénicité du vaccin ^3. Les pays en développement sont encouragés à mûrir, chargées avec des antigènes peptidiques, et incubées pendant la nuit. Au jour 7, les cellules sont lavées, et congelés dans aliquotes de 1 ml contenant4 - 20 x 10 ⁶ cellules en utilisant un congélateur à vitesse contrôlée. essai de libération du lot pour les lots des PED est effectuée et doit respecter les spécifications minimales avant d'être injectés dans patients.

Protocole

1. L'isolement et la cryoconservation des PBMC ⁴

1. Aseptiquement pointe l'un des orifices d'accès à la poche de cytaphérèse aide d'un ensemble de transfert de plasma. En utilisant une seringue de 60 ml, transférer la cytaphérèse provenant de patients dans un flacon de 500 ml stérile.
2. Réglez le volume de la cytaphérèse 2x son volume initial en utilisant la température ambiante RPMI. Mélanger soigneusement.
3. Mélanger délicatement la bouteille de Ficoll-Paque PLUS. Ajouter 12 ml PLUS Ficoll-Paque dans le tube conique stérile de 50 ml.
4. Couche doucement 30 ml de produit de leucaphérèse dilué dans chaque tube....

Résultats

Entre 10 - 20% des CMSP départ se différencient en DC à la fin de la période de culture. CD matures sont CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 +, et CCR7 + (Figure 1). Ils expriment des niveaux élevés de molécules CMH de classe II et I et les molécules de co-stimulation CD80 et CD86. Poly-ICLC a également induit des niveaux inférieurs de PDL-1 par rapport à d'autres agonistes TLR ^14. En outre, ces Poly-IC-mûri PED sécrètent de grandes quantités d'IL-12 (Figure 2 et ^{15,16).......}

Discussion

Phase I et II des essais cliniques de DC dérivées de monocytes ont montré qu'ils induisent des réponses immunitaires chez les patients mais le succès clinique a été limitée ^1. Cela peut être dû en partie à l'absence de consensus sur la façon de générer les PED optimale pour une utilisation immunothérapie des tumeurs. Bien qu'il existe de nombreuses façons de générer des contrôleurs de qualité clinique, ces méthodes varient en fonction de l'utilisation de cytokines utilisées pour différencier l.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RPMI-1640 milieu avec L-glutamine	BioWhittaker	12-702F
1M HEPES sérum physiologique tamponné	BioWhittaker	17-737E
Phosphate salin tamponné (PBS)	BioWhittaker	17-516F
Albumine humaine, solution à 25 % USP	Aventis Behring
Ficoll-Hypaque PREMIUM	GE Healthcare	17-5442-03
Sérum AB humain	Valley Biomedical	HP1022
Solution saline stérile USP	Hospira
CryoMACS DMSO	Miltenyi Biotec	170-076-303
Leukine GM-CSF, 0,5 mg/ml	Berlex	A02266
MACS GMP IL-4	Miltenyi Biotec	170-076-101
Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml	Oncovir	NA
VACMUNE KLH	Biosyn
225 cm² EasyFlasks	Nalgene Nunc	159934
Falcon Plaques de culture tissulaire à 6 puits	Becton Dickinson	353046
1,8 ml CryoTube flacons	Nalgene Nunc	377267
Congélateur à débit contrôlé	Thermo	CryoMed