Preparazione del Tumor Antigen-caricati mature cellule dendritiche per l'immunoterapia
Summary
Il metodo più comunemente utilizzato per generare un elevato numero di cellule dendritiche autologhe (DC) per uso in immunoterapia tumore è descritto. Il metodo utilizza IL-4 e GM-CSF per differenziare DC da monociti. Le DC immature sono stimolati a maturo e poi caricato con antigeni prima di essere iniettati nel paziente.
Abstract
Mentre gli studi clinici hanno dimostrato che i vaccini DC antigene-caricati sono al sicuro e promettente terapia per i tumori 1, la loro efficacia clinica rimane da stabilire. Il metodo descritto di seguito, redatto in conformità con buon processo di fabbricazione (GMP), è una ottimizzazione del metodo di preparazione ex vivo più comuni per la generazione di un gran numero di cellule dendritiche per gli studi clinici 2.
Il nostro metodo utilizza il TLR sintetico 3 agonista Polyinosinic-policitidilico Carbossimetilcellulosa acido poli-L-lisina (Poly-ICLC) per stimolare i PVS. Nostro studio precedente stabilito che Poly-ICLC è il più potente stimolo maturazione individuale per DCs umane valutata da una sovraregolazione di CD83 e CD86, induzione di interleuchina-12 (IL-12), fattore di necrosi tumorale (TNF), interferone gamma-indotta proteina 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), e interferoni di tipo I (IFN), e minimale interleuchina 10 (IL-10) di produzione. </p>
DC sono differenziati da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC congelati) ottenuti da leucaferesi. PBMC vengono isolati mediante centrifugazione su gradiente Ficoll e congelati in aliquote. Il giorno 1, PBMC vengono scongelati e piastrate su fiasche di coltura tissutale di selezionare per i monociti che aderiscono alla superficie plastica dopo 1-2 ore di incubazione a 37 ° C in incubatore coltura tissutale. Dopo l'incubazione i linfociti vengono lavati via ed i monociti aderenti sono coltivate per 5 giorni in presenza di interleuchina-4 (IL-4) e granulociti macrofagi fattore stimolante le colonie (GM-CSF) per differenziare a DC immature. Il giorno 6, DC immature vengono pulsate con l'emocianina di patella (KLH) keyhole proteina che serve come un controllo per la qualità del vaccino e può aumentare l'immunogenicità del vaccino 3. Le cellule dendritiche sono stimolati a maturare, caricati con antigeni peptidici, e incubate per una notte. Il giorno 7, le cellule vengono lavate, e congelati in aliquote da 1 ml contenente4 – 20 x 10 6 cellule usando un congelatore a velocità controllata. Controllo del rilascio del lotto per i lotti di DCS viene eseguito e deve soddisfare requisiti minimi prima di essere iniettati nel paziente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fase I e II di sviluppo clinico di DC derivate da monociti hanno dimostrato che inducono risposte immunitarie nei pazienti però il successo clinico è stato limitato 1. Ciò può essere dovuto in parte alla mancanza di consenso su come generare il DCS ottimali per uso immunotherapeutic tumore. Sebbene ci siano molti modi per generare DC ad uso clinico, questi metodi variano in termini di uso di citochine utilizzati per differenziare i monociti, stimoli usati per indurre la maturazione, e metodi di antigene c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Andres Salazar (Oncovir, Inc.) per il dono della Poli-ICLC.
Materials
| Reagent/Supplies/Equipment | Manufacturer | Catalog No. | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES buffered saline | BioWhittaker | 17-737E | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Human albumin, 25% solution USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Sterile saline USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 sq cm EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-well tissue culture plates | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1.8 ml CryoTube vials | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Controlled Rate Freezer | Thermo | CryoMed |
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