Bir Zebra balığı Otokton Tümör Modeli kullanılarak Melanom Değiştiricileri için Tarama
Summary
Bir zebrafish otokton tümör modeli kullanılarak melanoma düzenleyiciler için ekran için hızlı bir şekilde sunulmaktadır. Bu melanosit aday melanom genlerin ifadesi için izin miniCoopR vektör yararlanır. Melanom sağkalım eğrileri, bir işgal testi, ölçek melanosit antikor boyama için bir protokol ve bir melanom nakli tahlil elde bir yöntem tarif edilmiştir.
Abstract
Insan kanserlerini Genomik çalışmalar tümörler 1,2,3 değişmiş genler hakkında bilgi bir zenginlik vermiştir. Bu çalışmalardan kaynaklanan bir zorluk birçok genin değişmiş olduğunu ve bu dönüşüm sırasında tesadüfen ortaya çıktığını gelen tümörogenez sürdü genetik bozukluklardan ayırt etmek zor olabilir. Bu ayrım çizmek için bunu kantitatif tümörler inat ve yaymak için izin tümör gelişimini ve diğer süreçlere değişmiş bir gen etkisini ölçebilen bir test olması faydalıdır. Burada melanom başlatılması ve bakımı için gerekli adımları kapsayan bir otokton tümör modeli 4 kullanarak zebrafish aday melanom değiştiriciler çok sayıda taranması için hızlı bir araç sunuyoruz. Bu tahlilde önemli bir reaktif olan bir ağ geçidi rekombinasyon kaset için çiftler mitfa melanosit şartname faktörünün bir vahşi-tip kopya miniCoopR vektör ki, burada aday haline melanomaliler genler 5 recombined. MiniCoopR vektör promotör, açık okuma çerçevesi ve yabani-tip mitfa geninin 3'-çevrilmemiş bölge içeren bir mitfa kurtarıcı minigene sahiptir. Bu bizi bir aday melanom modifiye tam boy açık okuma çerçeveleri ile yapılar yapmak için olanak sağlar. P53 (lf);; mitfa (lf) zebrafish embriyolar: Bu bireysel klonlar daha sonra tek hücre Tg (BRAF V600E mitfa) enjekte edilebilir. MiniCoopR vektör Tol2-aracılı transgenesis 6 ile entegre ve melanosit kurtarır alır. Fiziksel mitfa kurtarıcı minigene birleştiğinde Çünkü, aday genler dönüştürmek ve tümörler dönüşecek bazıları kurtarıldı melanosit olarak ifade edilmiştir. Melanom başlatılması ve melanom hücre özelliklerini bir aday genin etkisi melanom sağkalım eğrileri, invazyon deneyleri, antikor boyama ve transplantasyon yöntemleri kullanılarak ölçülebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
MiniCoopR yöntem zebrafish melanosit ilgi genlerinin ifadesini sağlar. Bu yaklaşım zebrafish mitfa geni hücre-özerk davrandığını aslında yararlanır. Bu nedenle, miniCoopR vektör tarafından kurtarıldı melanosit minigene ve fiziksel birleştiğinde ilgilendiren herhangi bir gen içeren kesin. Kurtarılan melanosit açıkça görülebilir ve tek hücreli embriyolar olarak enjekte edilmiştir hayvanlarda elde edilebilir. Kimerizmin Belirtilen derecesi seçilir, ve bu kesim aşarak hayvanlar tümör …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ve James Neiswender; Kristen Kwan ve bu çalışmada kullanılan plazmid hediyeler için geç Chi-Bin Chien;; antikor boyama ile ilgili yardım için James Lister ve David Raible Biz kimin laboratuar bu teknikleri başlangıçta geliştirilen Dr Leonard I. Zon ederim mikroenjeksiyon video. Bu çalışma CJC için NIH hibe R00AR056899-03 tarafından finanse edilmiştir
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
References
- Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
- Curtin, J. A., et al. Distinct sets of genetic alterations in melanoma. N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).
- Lin, W. M., et al. Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma. Cancer Res. 68, 664-673 (2008).
- Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).
- Ceol, C. J., et al. The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset. Nature. 471, 513-517 (2011).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
