La detección de Modificadores melanoma utilizando un modelo de pez cebra Tumor autóctona
Summary
Una forma rápida de pantalla para los modificadores de melanoma utilizando un modelo de pez cebra tumor autóctona se presenta. Se aprovecha de la miniCoopR vector que permite la expresión de los genes candidatos de melanoma en los melanocitos. Un método para obtener gratis melanoma curvas de supervivencia, un ensayo de invasión, un protocolo para la tinción de anticuerpos de los melanocitos de escala y un ensayo de trasplante de melanoma se describen.
Abstract
Los estudios genómicos de cáncer en humanos han arrojado una gran cantidad de información acerca de los genes que están alterados en los tumores 1,2,3. Un desafío que surge de estos estudios es que muchos genes están alterados, y puede ser difícil distinguir las alteraciones genéticas que impulsaron la tumorigénesis de aquellos que surgió incidentalmente durante la transformación. Para hacer esta distinción es beneficioso tener un ensayo que puede medir cuantitativamente el efecto de un gen alterado en la iniciación del tumor y otros procesos que permiten a los tumores a persistir y difundir. Aquí presentamos un medio rápido para detectar un gran número de candidatos modificadores de melanoma en el pez cebra utilizando un modelo de tumor 4 autóctona que abarca los pasos necesarios para la iniciación y el mantenimiento de melanoma. Un reactivo clave en este ensayo es el vector miniCoopR, que acopla una copia de tipo salvaje del factor de especificación mitfa melanocitos a un casete de recombinación Gateway en el que candidato melAnoma genes pueden ser recombinados 5. El vector miniCoopR tiene un minigen rescate mitfa que contiene el promotor, marco de lectura abierta y la región 3 'no traducida del gen de tipo salvaje mitfa. Nos permite hacer construcciones con larga duración marcos de lectura abierta de modificadores de melanoma candidatos. Estos clones individuales pueden ser inyectados en célula única Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (lf) embriones de pez cebra. El vector miniCoopR se integra por Tol2 transgénesis mediada 6 y rescata a los melanocitos. Debido a que están físicamente acoplado a la minigen mitfa rescate, genes candidatos se expresa en los melanocitos rescatadas, algunas de las cuales se transforman y se desarrollan en tumores. El efecto de un gen candidato en la iniciación melanoma y propiedades celulares de melanoma se puede medir usando libres melanoma curvas de supervivencia, los ensayos de invasión, tinción de anticuerpos y ensayos de trasplante.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método miniCoopR permite la expresión de genes de interés en los melanocitos de pez cebra. Este enfoque tiene la ventaja del hecho de que el gen de pez cebra mitfa actúa células autónoma. Por esta razón, los melanocitos rescatadas por el vector miniCoopR son determinados para contener el minigen y cualquier gen de interés al que está acoplado físicamente. Melanocitos rescatados son claramente visibles y pueden ser obtenidos en los animales que fueron inyectados como una sola célula de los embrione…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Leonard I. Zon en cuyo laboratorio estas técnicas fueron desarrolladas inicialmente; Kwan Kristen y el difunto Chi-Bin Chien para los regalos de los plásmidos utilizados en este trabajo, James Lister y Raible David para obtener ayuda con la tinción de anticuerpos, y por James Neiswender el vídeo de microinyección. Este trabajo fue financiado por el NIH subvención R00AR056899-03 a CJC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
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