Screening för melanom Modifieringar med en Zebrafish Autoktont tumörmodell
Summary
Ett snabbt sätt att screena för melanom modifierare med en zebrafisk autoktona tumörmodell presenteras. Det drar fördel av miniCoopR vektor som tillåter uttryck av gener kandidat melanom i melanocyterna. En metod för att få melanom överlevnad kurvor, en invasion assay, ett protokoll för antikroppar färgning av skala melanocyter och en melanom transplantation analys beskrivs.
Abstract
Genomiska studier av cancer hos människa har gett en mängd information om gener som är förändrade i tumörer 1,2,3. En utmaning som härrör från dessa studier är att många gener förändras, och det kan vara svårt att skilja genetiska förändringar som drev tumörgenes från att de uppstod för övrigt under förändring. Att dra denna distinktion är det fördelaktigt att ha en analys som kvantitativt kan mäta effekten av en förändrad gen på tumörinitiering och andra processer som möjliggör tumörer att kvarstå och sprida. Här presenterar vi en snabb sätt att screena ett stort antal modifierare kandidat melanom i zebrafisk med ett autoktont 4 tumör modell som omfattar steg som krävs för melanom initiering och underhåll. En viktig reagens i denna analys är miniCoopR vektorn, som kopplar en vild-typ kopia av mitfa melanocyt specifikationen faktor till en gateway rekombination kassett i vilken kandidat melAnoma gener kan rekombineras 5. Den miniCoopR vektorn har en mitfa rädda minigen som innehåller promotorn, öppna läsramen och 3'-otranslaterade regionen av vildtyp mitfa genen. Det ger oss möjlighet att göra konstruktioner som använder full längd öppna läsramar av modifierare kandidat melanom. Dessa enskilda kloner kan sedan injiceras i en enda cell Tg (mitfa: BRAF V600E), p53 (LF), mitfa (LF) zebrafisk embryon. Den miniCoopR vektorn blir integrerat med Tol2-medierad transgenes 6 och räddar melanocyter. Eftersom de är fysiskt kopplade till mitfa rädda minigenen, är kandidatgener uttrycks i melanocyter räddade, av vilka vissa kommer att förvandla och utvecklas till tumörer. Effekten av en kandidat gen på melanom initiering och melanom cellegenskaper kan mätas med hjälp melanom överlevnad kurvor, analyser invasion, antikroppar färgning och analyser transplantation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den miniCoopR Metoden möjliggör uttryck av gener av intresse i zebrafisk melanocyter. Detta tillvägagångssätt drar fördel av det faktum att zebrafisk mitfa genen fungerar cell-autonomt. Av denna anledning, melanocyter räddas av miniCoopR vektorn är säker på att innehålla minigenen och varje gen av intresse till vilken den är fysiskt kopplad. Räddade melanocyter är klart synliga och kan erhållas i djur som injicerades som encelliga embryon. En specificerad grad av chimerism väljs och djur övertr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Leonard I. Zon i vars laboratorium dessa tekniker ursprungligen utvecklades, Kristen Kwan och den sena Chi-Bin Chien för gåvor av plasmider som används i detta arbete, James Lister och David Raible för hjälp med antikroppar färgning, och James Neiswender för mikroinjektion videon. Detta arbete har finansierats av NIH bidrag R00AR056899-03 till CJC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
References
- Beroukhim, R., et al. The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers. Nature. 463, 899-905 (2010).
- Curtin, J. A., et al. Distinct sets of genetic alterations in melanoma. N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).
- Lin, W. M., et al. Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma. Cancer Res. 68, 664-673 (2008).
- Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).
- Ceol, C. J., et al. The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset. Nature. 471, 513-517 (2011).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
