核糖体RNA的蚊子肠道宏基因组RNA-seq的枯竭
Summary
核糖体RNA（rRNA）的消耗协议的开发是为了丰富信使RNA（mRNA），RNA-seq中蚊子的肠道metatranscriptome的。由蚊子和其肠道微生物样品的具体rRNA探针，用于去除rRNA基因通过减法，创建了。协议的性能的影响，可能会导致在约90-99％的rRNA基因的去除。
Abstract
蚊子肠道适应动态的微生物群落昆虫的生命周期的不同阶段之间。表征的遗传能力和功能的肠道社区将提供洞察肠道菌群的影响蚊子的生命特质。宏基因组RNA序列分析转录从各种微生物，微生物群落，已经成为一个重要的工具。信使RNA通常仅包括1-3％的总RNA，而rRNA基因构成约90％。它是具有挑战性的丰富信使RNA从宏基因组微生物的RNA样品的原核表达，因为大多数物种缺乏稳定的poly（A）尾巴。这可以防止寡聚d（T）介导的mRNA隔离。在这里，我们描述了一个协议，采用衍生rRNA基因的捕获探针删除rRNA基因从宏基因组总RNA样品的样品。首先，蚊子和社区从宏基因组DNA样品的微生物和大亚基rRNA基因片段的扩增。然后，在交流了nity特定的生物素化的反义核糖体RNA的探针使用T7 RNA聚合酶在体外合成。的生物素化的rRNA基因探针杂交的总RNA。杂交捕获由链霉亲和素包被的磁珠，从总RNA中移除。基于此减法协议有效地消除蚊子和从总RNA样品中的微生物的rRNA。 mRNA的富集样品被进一步处理的RNA扩增和RNA序列。
Introduction
新一代测序技术已经极大地推进了宏基因组学研究评估的分类组成和遗传功能的微生物组合。 RNA测序（RNA-Seq的）可以绕过文化为基础的方法，，调查微生物metatranscriptomes在不同的情况下2-5。微生物的RNA-seq的一个主要障碍是丰富表达的困难，没有稳定的聚腺苷酸化的原核细胞的mRNA分子。因此，寡d（T）介导的信使富集是不适用的。删除丰富的rRNA基因是一种替代方法来丰富表达。耗竭商业rRNA基因包，如细菌的mRNA Microexpress富集试剂盒（Ambion），RiboMinus转录分离试剂盒（细菌）（Life Technologies公司），和的mRNA-ONLY原核mRNA分离试剂盒（震中）优先降解与核酸外切酶的rRNA基因，已经使用了除去rRNA的6-8。然而，捕获探针Microexpress或RiboMinus用于除去已知的rRNA从典型的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌（参见制造商的规格）是良好的，但不兼容从未知的微生物与rRNA。因此，去除效率可能较低宏基因组样品8-10。此外，mRNA丰度的保真度是有问题的核酸外切酶处理时，适用11。总体而言，基于减法rRNA基因消耗较少偏见的和更有效的宏基因组的基因富集设置10-13。
蚊子肠道容纳一个充满活力的微生物群落14。我们有兴趣在蚊子的肠道微生物利用RNA-Seq的功能特征。在一个分离的RNA样品由蚊子胆量，蚊子和微生物的RNA存在。在这里，我们描述了修改后的协议，使用社区的具体rRNA探针能够有效地消耗蚊子和微生物的rRNA基因消减杂交技术。所得mRNARNA-Seq的丰富的样本是适当的。在图1中示出的整体的工作流。
Protocol
Representative Results
Discussion
一个复杂的微生物群落居住在蚊子的肠道生态系统的14,16,17。 Metatranscriptomic测序（RNA-seq的）上下文相关的功能信息可以透露讯问的整个微生物的转录4,18。从技术上讲，低聚的d（T）介导的富集的原核mRNA的是不适用的，由于缺乏稳定的聚（A）尾的使者。或者，rRNA的耗尽已用于mRNA的富集。在这里，我们开发了消耗rRNA基因rRNA基因探针，从自己在蚊子的肠道微生物群落宏基因组DNA一?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由NIH授予1SC2GM092789，-01A1，MS新墨西哥州立大学霍华德·休斯医学院校本科研究项目的研究学者。录影被指挥和生产由Amy Lanasa和协调的菲利普·刘易斯博士在新墨西哥州立大学的创意媒体学院。
Materials
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
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