Summary

Proencefalo registrazione elettrofisiologica in larvale Zebrafish

Published: January 24, 2013
doi:

Summary

Un metodo semplice per registrare potenziali di campo extracellulari nel proencefalo larvale zebrafish è descritto. Il metodo fornisce un robusto<em> In vivo</em> Lettura di sequestro un'attività simile. Questa tecnica può essere utilizzata con le larve di zebrafish geneticamente modificati portando epilessia geni correlati o convulsioni evocate dalla somministrazione di farmaci convulsivanti.

Abstract

L'epilessia colpisce circa 3 milioni di persone negli Stati Uniti e fino a 50 milioni di persone in tutto il mondo. Definito come il verificarsi di convulsioni non provocate spontanee, epilessia può essere acquisita a seguito di un insulto al cervello o una mutazione genetica. Gli sforzi per sequestri modello su animali hanno principalmente utilizzato acquisito insulti (farmaci convulsivanti, stimolazione o lesione cerebrale) e manipolazioni genetiche (atterramento antisenso, ricombinazione omologa o transgenesi) nei roditori. Zebrafish sono un sistema modello vertebrato 1-3 che potrebbe fornire una valida alternativa al roditore ricerca basata epilessia. Zebrafish sono ampiamente utilizzati nello studio dei vertebrati genetica o di sviluppo, presentano un elevato grado di somiglianza genetica ai mammiferi ed esprimere omologhi per ~ 85% di umani noti singolo gene mutazioni epilessia. A causa delle loro piccole dimensioni (4-6 mm di lunghezza), larve di zebrafish può essere mantenuta in volumi di fluido a partire da 100 pl durante lo sviluppo precoce e ARRAYED in multi-pozzetti. I reagenti possono essere aggiunti direttamente alla soluzione in cui gli embrioni sviluppano, semplificando la somministrazione del farmaco e consentendo un rapido screening in vivo di composti di prova 4. Oligonucleotidi sintetici (Morpholinos), mutagenesi, zinc finger nucleasi e approcci transgenici possono essere utilizzati per generare rapidamente knockdown gene o mutazione in zebrafish 5-7. Queste proprietà permettersi studi zebrafish senza precedenti analisi statistica vantaggio potere roditori nello studio di disturbi neurologici come l'epilessia. Poiché il "gold standard" per la ricerca l'epilessia è quello di monitorare e analizzare le scariche elettriche anomale che hanno origine in una struttura cerebrale centrale (ad esempio, convulsioni), un metodo per registrare in modo efficiente l'attività cerebrale in larvale zebrafish è descritto qui. Questo metodo è un adattamento dei tradizionali tecniche di registrazione extracellulari e permette stabile monitoraggio a lungo termine di attività cerebrale in larve di zebrafish intatto. Sregistrazioni ampie sono mostrate per crisi acute indotte da bagno applicazione di farmaci convulsivanti e sequestri spontanei registrati in un pesce geneticamente modificato.

Protocol

1. Uovo di produzione e raccolta Zebrafish allevamento segue le procedure standard descritte in precedenza 8. In breve, zebrafish adulti vengono impostate in acquari di riproduzione con divisori in atto. Quando le luci in sala si accendono la mattina seguente, divisori vengono rimossi da acquari di riproduzione e pesci sono autorizzati circa 20 a 60 minuti di tempo di accoppiamento indisturbato. Uova da vasche di allevamento sono raccolti in un colino e sciacquato con acqua uovo. Uova ven…

Representative Results

Esempi di elettrografico sequestro-come scarico registrata nel proencefalo di agar-embedded larve zebrafish sono mostrati nella Figura 1. Grande ampiezza multi-picco di scarico scoppio in questi campioni è stata evocata da bagno applicazione di un farmaco convulsivante, 40 pilocarpina mM (in A, 6 dpf) o 1 picrotossina mM (in B, 8 dpf). In queste registrazioni, immobilizzato e agar-embedded zebrafish sono continuamente monitorati per un massimo di 90 min. Pesce rimangono vitali in queste condizioni di r…

Discussion

Il metodo di registrazione extracellulare qui presentata consente un'analisi molto sensibile e rapida di attività cerebrale. Queste registrazioni sono analoghi a elettroencefalografico (EEG) monitoraggio comunemente utilizzato per valutare la presenza di scarica elettrica anomala (cioè, sequestro) in modelli di roditori di epilessia 11 e 12 pazienti. Registrazioni extracellulari possono essere combinati con manipolazioni farmacologiche, come illustrato di seguito. Questi tipi di regi…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L'autore desidera ringraziare Peter Castro e Matteo Dinday per i loro primi sforzi per stabilire zebrafish in laboratorio. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health EUREKA sovvenzione (# R01NS079214-01).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Agarose low melting Fisher-Scientific BP1360-100 Dissolve in embryo media at 1.2%
Recording media Fisher-Scientific BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2
pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH
Tricaine Argent Labs MS-222 0.02%
α-bungarotoxin Tocris Bioscience 2133 1 mg/ml
Capillary glass tubing Warner Instruments G120TF-3 Pull to a resistance of 2 -7 MΩ
Patch clamp amplifier Warner Instruments PC-505B We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions.
Filter/amplifier Cygnus Technology FLA-01 We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer’s instructions.
Axon A/D board and Axoscope software Molecular Devices Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 kHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer’s instructions.
Egg water Instant Ocean   3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water

References

  1. Clark, K. J., et al. Stressing zebrafish for behavioral genetics. Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49 (2011).
  2. Rinkwitz, S., et al. Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences. Progress in Neurobiology. 93 (2), 231 (2011).
  3. Penberthy, W. T., et al. The zebrafish as a model for human disease. Frontiers in Bioscience. 7, d1439 (2002).
  4. Letamendia, A., et al. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS One. 7, e36690 (2012).
  5. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216 (2000).
  6. Haffter, P., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line. Development. 123, 1 (1996).
  7. Suster, M. L., et al. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Molecular Biology. 561, 41 (2009).
  8. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  9. Baraban, S. C., et al. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neurosciences. 131 (3), 759 (2005).
  10. Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48 (6), 1151 (2007).
  11. Williams, P., et al. The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39 (2006).
  12. Marsh, E. D., et al. Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients. Epilepsia. 51 (4), 592 (2010).
  13. Zhu, C., et al. Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish. Development. 138 (20), 4555 (2011).

Play Video

Citer Cet Article
Baraban, S. C. Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish. J. Vis. Exp. (71), e50104, doi:10.3791/50104 (2013).

View Video