Molekylær Imaging til TARGET Transplanterede Muskel progenitorceller
Summary
En ikke-invasiv måde at evaluere succes myoblast transplantation er beskrevet. Fremgangsmåden drager fordel af en samlet fusion reportergen bestående af gener, hvis ekspression kan afbildes med forskellige billeddannende modaliteter. Her vil vi gøre brug af en<em> Udsving</em> Reportergen sekvens til målceller via bioluminescens billeddannelse.
Abstract
Duchenne muskeldystrofi (DMD) er en alvorlig genetisk neuromuskulær lidelse, der påvirker 1 på 3.500 drenge, og er kendetegnet ved progressiv muskel degeneration 1, 2. Hos patienter, bliver evnen til residente muskel satellit celler (SCS) at regenerere beskadigede myofibre stadig ineffektiv 4. Derfor transplantation af muskel progenitorceller (MPL) / myoblaster fra raske personer er en lovende terapeutisk tilgang til DMD. En væsentlig begrænsning i anvendelsen af stamcellebehandling er imidlertid en mangel på pålidelige billeddannende teknologier til langtidsovervågning af implanterede celler, og for at evaluere dens effektivitet. Her beskriver vi et ikke-indtrængende, real-time fremgangsmåde til at evaluere effekten af myoblast transplantation. Denne fremgangsmåde drager fordel af en samlet fusion reportergen bestående af gener (ildflue-luciferase [udsving], monomert rødt fluorescerende protein [mrfp] og sr39 thymidinkinase [sr39tk]), hvis expression kan afbildes med forskellige afbildningsmodaliteter 9, 10. En række forskellige billeddannende modaliteter, herunder positronemissionstomografi (PET), single-photon emission computed tomography (SPECT), magnetisk resonansbilleddannelse (MRI), optisk billeddannelse og højfrekvens 3D-ultralyd er nu tilgængelige, hver med unikke fordele og begrænsninger 11. Bioluminescens imaging (BLI) undersøgelser, for eksempel har den fordel, at relativt lave omkostninger og højt gennemløb. Det er af denne grund, at det i denne undersøgelse, har vi gør brug af ildflue-luciferase (udsving) reportergen sekvens indeholdt i fusionsgenet og bioluminescens billeddannelse (BLI) for den korte lokalisering af levedygtige C2C12 myoblaster efter implantation i en mus model for DMD (muskeldystrofi på X-kromosomet [MDX] mus) 12-14. Vigtigere, BLI giver os et middel til at undersøge kinetikken af mærkede Middelhavspartnerlandene post-implantation, og vil være nyttigt at spore celler gentagne gange over time og efterfølgende migration. Vores reporter gen tilgang yderligere giver os mulighed for at flette flere billeddiagnostiske metoder i en enkelt levende emne; givet tomografisk natur, fine rumlige opløsning og evne til at skalere op til større dyr og mennesker 10,11, vil PET danner grundlag for det fremtidige arbejde, som vi antyder kan lette hurtig translation af metoder udviklet i celler til prækliniske modeller og kliniske anvendelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne undersøgelse har vi beskrevet en hurtig og pålidelig molekylær billeddannelse, reportergen tilgang til ikke-invasivt target myoblaster / Middelhavspartnerlandene efter transplantation. Selv om denne undersøgelse viser den korte lokalisering af transplanterede Middelhavspartnerlandene via bioluminescense imaging (BLI), den måde, hvorpå celler målrettes kan faktisk let anvendes til en langsgående vurdering af celle-transplantation, ved implantation af celler, der stabilt udtrykker reporte…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Sanjiv Gambhir for den gave af fluc/mrfp/sr39tk reportergenet. Dette arbejde blev finansieret af The Stem Cell Network (SCN) i Canada, og The Jesse Journey Foundation.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
- Emery, A. E. The muscular dystrophies. Lancet. 359, 687-695 (2002).
- Blake, D. J., et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Goldring, K., Partridge, T., Watt, D. Muscle stem cells. J. Pathol. 197, 457-467 (2002).
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Moss, F. P., Leblond, C. P. Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats. Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).
- Snow, M. H. An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats. Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol. Med. 14 (2), 82 (2008).
- Hoffman, E. P., et al. Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne’s or Becker’s muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67 (7), 3085 (2007).
- Ray, P., et al. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Mattson, M. P. . Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience. X, 294 (2001).
- Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse. J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).
