L&#39;imagerie moléculaire à la cible transplanté des cellules progénitrices musculaires

Kelly Gutpell; Rebecca McGirr; Lisa Hoffman

doi:10.3791/50119

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Article de méthode

L'imagerie moléculaire à la cible transplanté des cellules progénitrices musculaires

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DOI :

10.3791/50119

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27 mars 2013

Kelly Gutpell¹^,² , Rebecca McGirr¹ , Lisa Hoffman¹^,²^,³

¹Imaging Program, Lawson Health Research Institute, ²Department of Anatomy and Cell Biology, Western University, ³Department of Medical Biophysics, Western University

Dans cet article

Résumé

A moyen non invasif pour évaluer le succès de la transplantation de myoblastes est décrite. La méthode tire parti d'un gène rapporteur de fusion unifié composé de gènes dont l'expression peut être visualisé avec différentes modalités d'imagerie. Ici, nous utilisons un Fluc gène rapporteur pour cibler les cellules par imagerie par bioluminescence.

Résumé

Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie grave maladie neuromusculaire héréditaire qui touche 1 personne sur 3.500 garçons, et est caractérisée par une dégénérescence progressive des muscles ^{1, 2.} Chez les patients, la capacité des résidents cellules satellites du muscle (SC) pour régénérer fibres musculaires endommagées devient de plus en plus inefficace ^4. Par conséquent, la transplantation de cellules souches musculaires (PPM) / myoblastes chez des sujets sains est une approche thérapeutique prometteuse pour la DMD. Une limitation majeure à l'utilisation de la thérapie de cellules souches, cependant, est le manque de technologies d'imagerie fiables pour suivi à long terme des cellules implantées, et pour en évaluer l'efficacité. Ici, nous décrivons un non-invasive et en temps réel approche pour évaluer le succès de la transplantation de myoblastes. Cette méthode tire parti d'un gène rapporteur de fusion unifié composé de gènes (la luciférase de luciole [fluctuations], la protéine fluorescente rouge monomère [RDRF] et SR39 thymidine kinase [sr39tk]) dont expression peut être visualisé avec différentes modalités d'imagerie ^{9, 10.} Une variété de modalités d'imagerie, y compris par émission de positons (TEP), émission à photon unique tomographie (SPECT), imagerie par résonance magnétique (IRM), l'imagerie optique et haute fréquence 3D échographie sont maintenant disponibles, chacune avec des avantages et des limites ^11. Bioluminescence d'imagerie (BLI) des études, par exemple, ont l'avantage d'être relativement peu coûteuse et à haut débit. C'est pour cette raison que, dans cette étude, nous nous servons de la luciférase de luciole (fluctuations) séquence du gène rapporteur contenue dans le gène de fusion et l'imagerie par bioluminescence (BLI) pour la localisation à court terme des myoblastes C2C12 viables suite à une implantation dans une souris modèle de la DMD (dystrophie musculaire sur le chromosome X [mdx] souris) ^12-14. Surtout, BLI nous fournit un moyen d'examiner la cinétique de PPM étiquetés post-implantation, et sera utile pour suivre les cellules de façon répétée sur time et après la migration. Notre approche gène rapporteur permet en outre de nous de fusionner plusieurs modalités d'imagerie dans un unique sujet vivant; étant donné la nature tomographique, fine résolution spatiale et sa capacité à évoluer jusqu'à plus grands animaux et les humains ^10,11, PET constituera la base des travaux futurs que nous suggèrent peut faciliter la traduction rapide des méthodes mises au point dans les cellules à des modèles précliniques et aux applications cliniques.

Protocole

1. Entretien et Propagation de myoblastes C2C12

Plaque de myoblastes C2C12 dans un flacon de ⁷⁵ cm2 et maintenir les cellules dans le sérum glucose à haute Dulbecco modifié Eagle (HG-DMEM) supplémenté avec du sérum de veau fœtal (SVF) à une concentration finale de 10%. Ne laissez pas les cellules à devenir confluentes, à tout moment, car cela appauvrissent la population myoblastique. Milieu doit être changé tous les autre billet journée:. Moyennes toujours chaude à 37 ° C dans un bain d'eau avant de l'utiliser.
Lorsque les myoblastes à environ 80% de confluence, les cellules de passage à un nouveau flacon. Aspirer milieu de culture. Laver les cellules avec 4-5 ml solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) pour éliminer toute trace de milieu de culture qui contient la trypsine-inhibiteur du sérum. Rincer brièvement la couche cellulaire avec 2-3 ml 0,25% (p / v) une solution de trypsine-EDTA pour dissocier les myoblastes adhérentes de la fiole. Aspirer la trypsine et la fiole dans l'étuve à 37 ° C pendant 5 min.
Pendant cette incubationtion, de préparer un nouveau flacon de 9 ml de HG-DMEM/10% de FBS à moyen terme. Après trypsinisation, ajouter 10 ml de milieu complet pour cellules et pipettes 4-5 fois pour assurer la collecte de toutes les cellules dans le milieu. Ajouter 1 ml de suspension cellulaire dans le ballon et incuber à nouveau 5% de CO ₂ à 37 ° C.

2. Transfection des cellules C2C12

Une fois que les cellules ont atteint 50% de confluence, transfecter selon les instructions du fabricant de Invitrogen. En bref, mélanger 90 ul de réactif Lipofectamine 2000 avec 4,5 ml d'OPTI-MEM moyenne. Dans un autre tube, mélanger 36 mg CMV-trifusion ADN du gène rapporteur avec 4,5 ml d'OPTI-MEM. Flick chaque tube de combiner et attendre 5 min. Mélanger le contenu des deux tubes, mélanger délicatement et incuber à température ambiante pendant trente minutes exactement. Remarque: Un second ballon devrait également être mis en place pour les cellules non transfectées qui ne reçoivent Lipofectamine et OPTI-MEM pour servir de témoin négatif.
Retirer moyen de cellules C2C12 et ajouter 15,5ml de milieu frais HG-DMEM/10% de FBS. Ajouter milieu de transfection pour amener le volume total à 20 ml.
Laisser les cellules à transfecter nuit pendant au moins 20 h à 37 ° C.
Le lendemain, aspirer milieu de transfection et ajouter 10 ml HG-DMEM/10% de FBS.
Voir les cellules sous un microscope inversé fluorescent. Capturer à la fois en champ clair et rouges des images de fluorescence (en utilisant un cube TRITC filtre; RDRF ex / em: 584/607 nm). Compter le nombre de cellules exprimant la DP-vues en fluorescence divisé par le nombre total de cellules vues sous un champ prometteur pour plusieurs champs de vision afin de générer efficacité de la transfection.

3. Évaluation de la cellule de survie / MTT Assay

Un jour avant la transfection, plaque de 1x10 ⁵ cellules C2C12 dans chaque puits d'une plaque de 24 puits. Les cellules doivent être étalées dans 500 volumes ul dans HG-DMEM/10% de FBS.
Le lendemain, les myoblastes transfecter nuit comme décrit précédemment. Suivez les recommandations du fabricant pour la transfection Reagenvolumes t pour une plaque de 24 puits. Incuber un ensemble de puits avec Lipofectamine uniquement (pas d'ADN) comme témoin. Voir les cellules en fluorescence afin de s'assurer que la transfection adéquate s'est produite.
Retirer milieu de transfection et de myoblastes incuber avec 5 mg / ml thiazolyle tétrazolium (MTT) en HG-DMEM/10% de FBS. Ajouter D-luciférine à huit des puits transfectées, et incuber à 37 ° C pendant quatre heures.
Éliminer le milieu des puits. Solubiliser bleu cristaux de formazan en ajoutant 180 pl d'isopropanol à chaque puits. Agiter à 37 ° C pendant 15 min.
En évitant toute solution de la pipette précipité, dans une plaque à 96 puits et lire l'absorbance à 575 nm.

4. Préparation de myoblastes pour transplantation

Éliminer le milieu, laver avec du HBSS myoblastes, cellules et trypsiniser comme indiqué en 1.1.
Remettre en suspension les cellules dans 4 ml de milieu complet.
En utilisant un hémocytomètre, compter les cellules de générer des volumes contenant 10 ⁶ myoblastes. Pipette volume dans des microtubes de 1,5 ml stériles. Avec une efficacité de transfection d'environ 10%, ces valeurs indiquent que 100.000 cellules exprimant la luciférase sont détectables sur le scanner GE ExploreOptix après la greffe.
Atteindre un volume d'injection final de 15 ul, contenant 10 ⁶ cellules C2C12. Si nécessaire, centrifuger microtubes à 2.000 tours par minute pendant une minute. Aspirer soigneusement le surnageant avec une pipette. Remettre en suspension les cellules dans 15 ul de DMEM dépourvu HG-FBS.

5. Implantation de cellules

Anesthésier la souris avec 2% d'isoflurane / _2% O 2. Pluck les poils de la région dorsale des pattes postérieures. Maintenir l'anesthésie à l'isoflurane 1,5% / _2% O 2.
Veiller à ce que myoblastes C2C12 sont bien suspendues. Avec la souris en position couchée, prolonger la patte arrière et utiliser une seringue à insuline à injecter des cellules directement dans le chef latéral du muscle gastrocnémien à un angle de 30 °. Injecter myoblastes transfectés dans le membre postérieur droit et non transfectées int myoblasteso le controlatérale (à gauche) des membres postérieurs.
Effectuez un balayage bioluminescence de base: Transférez rapidement la souris à l'étape du scanner optique, la pose de la souris dans une position couchée. Branchez la ligne d'anesthésie. Pour garantir la souris reste anesthésié, une deuxième personne doit être présente pour brancher la ligne anesthésie tandis que les autres endroits de l'animal dans le scanner.
Doucement prolonger la patte arrière de sorte que la zone d'injection est visible. Membres de bandes arrières en place avec un adhésif doux comme du ruban médical.
Fermer la chambre et faire en sorte que la lumière ne peut accéder à l'intérieur du scanner, car cela augmente le signal d'arrière-plan détecté. Le scanner doit être réglé sur les paramètres inclus dans les instructions de votre fabricant pour l'imagerie par bioluminescence. En particulier, assurez-vous «pas de laser" est sélectionné.
Dessinez une région d'intérêt (ROI) autour de la zone de balayage plumé et de départ.

6. L'injection de substrat Fluc, D-luciférine, en souris mdx

Alors que la souris est anesthésié par voie intrapéritonéale injecter 150 mg / kg de substrat de luciférase de luciole, D-luciférine (à partir de 40 mg / ml de solution concentrée, constituée selon les instructions du fabricant).
Récupérer la souris et permettent une durée de 15 min avant de préparer l'absorption de la souris pour le cycle suivant.

7. BLI à la cible Luc exprimant PPM Après l'implant dans les modèles murins de la DMD

Après la période d'absorption, anesthésier la souris à nouveau, comme décrit au paragraphe 5.1.
Transférer la souris vers le dispositif de balayage optique et d'effectuer un autre balayage bioluminescence de la même manière que le balayage de fond.
Même si une période de 20 min absorption devrait fournir l'intensité du signal maximal, une analyse a posteriori peut être effectuée.
A l'issue de l'acquisition d'image, sacrifiez la souris selon les lignes directrices établies par votre animal institutionnel du Comité d'éthique et le Conseil canadien de protection des animaux (CCPA). Isoler les muscles des membres postérieurs et lieu immédiatement in formol à 10% de fixer pour l'encastrement de paraffine. Effectuer la coloration immunohistochimique pour la luciférase pour confirmer l'injection intramusculaire de myoblastes.