Молекулярная визуализация на цель трансплантированных клеток-предшественников мышц
Summary
Неинвазивных средств для оценки успеха пересадки миобластов описано. Метод использует единый ген-репортер слияния состоит из генов, экспрессия которых могут быть выявлены различные методы визуализации. Здесь мы воспользуемся<em> Флуктуации</em> Репортер последовательности генов к клеткам-мишеням с помощью биолюминесценции изображений.
Abstract
Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является тяжелой генетической нервно-мышечные расстройства, которое поражает 1 из 3500 мальчиков и характеризуется прогрессирующей дегенерацией мышц 1, 2. У пациентов, способности резидентных клеток спутниковой мышцы (ПК) для восстановления поврежденных мышечных волокон становится все более неэффективной 4. Таким образом, пересадка мышц клетки-предшественники (ПДК) / миобластов у здоровых людей является перспективным терапевтическим подходом к DMD. Основным ограничением к использованию стволовых клеток, однако, является отсутствие надежных технологий визуализации для долгосрочного мониторинга имплантированных клеток, а также для оценки ее эффективности. Здесь мы описываем неинвазивным, в режиме реального времени подход к оценке успешности трансплантации миобластов. Этот метод использует единый ген-репортер слияния состоит из генов (люциферазы светляков [флуктуаций], мономерного красного флуоресцентного белка [mrfp] и SR39 тимидинкиназы [sr39tk]), чьи Expression могут быть отображены различные методы визуализации 9, 10. Различные методы визуализации, включая позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), однофотонная эмиссионная компьютерная томография (ОФЭКТ), магнитно-резонансная томография (МРТ), оптических изображений, и высокая частота 3D-УЗИ теперь доступны, каждый со своими уникальными преимуществами и ограничениями 11. Биолюминесценции изображений (BLI) исследования, например, имеют то преимущество, что относительно низкой стоимости и высокой пропускной способностью. Именно по этой причине, что в этом исследовании, мы используем люциферазы светляков (флуктуации), репортер последовательности генов, содержащихся в геном синтеза и биолюминесценции изображений (BLI) для краткосрочных локализации жизнеспособной C2C12 миобластов после имплантации в мышь модель DMD (мышечная дистрофия на Х-хромосоме [MDX] мышь) 12-14. Важно отметить, что BLI предоставляет нам средства для изучения кинетики меченого ПДК после имплантации, а также будет полезна для отслеживания клетки неоднократно в течение тIME и последующие миграции. Наш корреспондент гена подход также позволяет нам объединить несколько методов визуализации в единый субъект жизни; учитывая томографических природы, прекрасные пространственным разрешением и способностью масштабироваться до более крупных животных и человека 10,11, ПЭТ лягут в основу будущей работы, которую мы предлагаю может способствовать быстрому переводу методы, разработанные в клетки доклинических моделях и клинического применения.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании мы описали быстрый и надежный молекулярной визуализации, ген-репортер подход к неинвазивным целевой миобластов / ПДК после трансплантации. Хотя это исследование демонстрирует краткосрочные локализации пересаженного ПДК по bioluminescense томография (BLI), манера,</em…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Sanjiv Gambhir за дар гена-репортера fluc/mrfp/sr39tk. Эта работа финансировалась по сети стволовых клеток (SCN) из Канады, и путешествие фонда Джесси.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| C2C12 myoblasts | ATCC | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Life Technologies | 12800-017 | |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 12483020 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-72 | |
| Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Nikon Eclipse TE2000-5 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Xenolight D-luciferin | PerkinElmer | 122796 | 40 mg/ml in PBS |
References
- Emery, A. E. The muscular dystrophies. Lancet. 359, 687-695 (2002).
- Blake, D. J., et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Goldring, K., Partridge, T., Watt, D. Muscle stem cells. J. Pathol. 197, 457-467 (2002).
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Moss, F. P., Leblond, C. P. Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats. Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).
- Snow, M. H. An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats. Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).
- Kuang, S., Rudnicki, M. A. The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential. Trends Mol. Med. 14 (2), 82 (2008).
- Hoffman, E. P., et al. Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne’s or Becker’s muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67 (7), 3085 (2007).
- Ray, P., et al. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Mattson, M. P. . Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience. X, 294 (2001).
- Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse. J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).
