Comment les réseaux neuronaux sont établis dans le cerveau embryonnaire est une question fondamentale en neurobiologie développementale. Ici, nous avons combiné une technique d'électroporation avec des outils génétiques nouvelles, comme Cre / Lox-plasmides et le système de transposition ADN PiggyBac médiation dans le cerveau postérieur aviaire à étiqueter interneurones dorsale et suivre leurs projections axonales et des cibles synaptiques à différents stades de développement.
Électroporation du tube neural embryonnaire poussin présente de nombreux avantages comme étant rapide et efficace pour l'expression de gènes étrangers dans des cellules neuronales. Dans ce manuscrit, nous proposons une méthode qui démontre unique façon d'électroporation d'ADN dans le cerveau postérieur aviaire à E2.75 pour étiqueter spécifiquement un sous-ensemble de progéniteurs neuronaux, et comment suivre leurs projections axonales et des cibles synaptiques à bien des stades avancés de développement, jusqu'à E14.5. Nous avons utilisé des outils génétiques nouveaux, y compris des éléments spécifiques enhancer, la CRE / Lox – Plasmides et que le système de transposition ADN PiggyBac médiation pour conduire l'expression de la GFP dans un sous-type de cellules du cerveau postérieur (la dorsale plus sous-groupe des interneurones, DA1). Trajectoires et les objectifs de dA1 axones axones sont suivis à des stades embryonnaires précoces et tardives à différentes régions du tronc cérébral. Cette stratégie contribue techniques avancées pour cibler des cellules d'intérêt dans le cerveau postérieur embryonnaire et pour tracement formation de circuit à plusieurs stades de développement.
Le cerveau postérieur représente une plaque tournante du relais clé du système nerveux par la communication entre les systèmes nerveux central et périphérique via ascendant et descendant des réseaux neuronaux. Il régule les fonctions de base, y compris la respiration, la conscience, l'audition et la coordination motrice 1-3. Au cours du développement embryonnaire, le cerveau postérieur vertébré est subdivisé de manière transitoire le long de son axe antéro-postérieur (AP) dans rhombomères répétitifs, dans lequel les types de cellules neuronales distinctes sont formées et générer de multiples centres des noyaux du tronc cérébral 4. Le cerveau postérieur est également divisé le long de son axe dorso-ventral (DV) dans une plaque basale et Alar, au cours de laquelle progéniteurs neuronaux distincts deviennent spécifiés et se différencient dans des endroits distincts DV 3,5,6. Comment le début AP et spécifiques DV modèles neuronaux sont relatives à la création de circuits de tronc cérébral fonctionnel est largement inconnue.
D'acquérir des connaissances sur ce principe fondamentalquestion, des outils sont nécessaires pour étiqueter sous-ensembles spécifiques de neurones dans le cerveau postérieur au début et à retracer leurs trajectoires axonales et la connectivité à des stades plus avancés. Nous avons déjà utilisé des éléments activateurs spécifiques, et un système d'expression conditionnelle Cre / loxP-base pour le suivi de trajectoire des axones des interneurones spinaux dorsaux au début embryon de poulet 7-9. Dans le manuscrit actuel, nous avons ciblé le cerveau postérieur et amélioré le paradigme expérimental pour l'étiquetage fin des interneurones du cerveau postérieur embryonnaire, les axones et leurs cibles synaptiques, en utilisant une stratégie d'électroporation modifié et le PiggyBac – transposition de l'ADN induite. Notre nouvelle stratégie permet le marquage des sous-types neuronaux distincts dans un côté du cerveau postérieur et le suivi de leurs projections axonales et les sites synaptiques à différents stades embryonnaires, à partir de 2 jusqu'à 12 jours après l'électroporation. Sur la base de cette méthode, nous avons appelé la dorsale la plus sous-groupe des interneurones du cerveau postérieur (dA1/Atoh1 + </s> Suivi des cellules) et révélé deux modèles de projections axonales ascendantes controlatéral, chacun vient d'un endroit et s'allonge AP différent dans un funiculus distinct. dA1 axones ont été trouvés à projet et le formulaire synapses dans les noyaux auditifs, le mésencéphale et dans de multiples couches du cervelet 10.
La combinaison de poussin électroporation, génétique traçage des neurones et analyse des sites de projection à bien des stades avancés de développement fournit une plate-forme unique d'étudier la formation des réseaux neuronaux dans le cerveau et à élucider les mécanismes moléculaires qui régissent la formation des circuits.
En électroporation in ovo est un outil réalisable, fiable et efficace pour examiner la spécification des cellules et le guidage axonal au cours de poussin développement du système nerveux 20. Dans ce protocole, nous décrivons un mode d'électroporation dans le cerveau postérieur de poulet à E2.75 utilisant des éléments amplificateurs qui permettent l'étiquetage conditionnelle des interneurones spécifiques. Cette stratégie est combiné avec le système de transposition Pi…
The authors have nothing to disclose.
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number |
L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes | BTX, Harvard Apparatus | 45-0162 |
pulse generator, ECM 830 | BTX, Harvard Apparatus | 45-0002 |
OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 O.C.T. Compound |
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