चिकी भ्रूण में axonal trajectories और Synaptic के लक्ष्य का पता लगाने के लिए hindbrain के electroporation
Summary
विकास तंत्रिका जीव विज्ञान में एक बुनियादी सवाल कैसे neuronal नेटवर्क भ्रूण मस्तिष्क में स्थापित कर रहे है. यहां हम ऐसे Cre / Lox-plasmids और पृष्ठीय interneurons लेबल और विभिन्न विकास के चरणों में अपने axonal अनुमानों और synaptic लक्ष्य को ट्रैक करने के लिए एवियन hindbrain में PiggyBac की मध्यस्थता डीएनए स्थानांतरण प्रणाली के रूप में उपन्यास आनुवंशिक उपकरणों के साथ एक electroporation तकनीक संयुक्त.
Abstract
लड़की भ्रूण न्यूरल ट्यूब के electroporation ऐसे neuronal कोशिकाओं में विदेशी जीनों की अभिव्यक्ति के लिए त्वरित और कुशल होने के रूप में कई फायदे हैं. इस पांडुलिपि में हम एक विशेष रूप से तंत्रिका progenitors के एक सबसेट लेबल करने के क्रम में E2.75 में एवियन पश्चमस्तिष्क में डीएनए electroporate को कैसे विशिष्ट दर्शाता है कि विधि, और कैसे विकास के अधिक उन्नत चरणों में अपने axonal अनुमानों और synaptic लक्ष्य का पालन करने के लिए प्रदान ऊपर E14.5 लिए. आधारित plasmids और पश्चमस्तिष्क कोशिकाओं (interneurons, डीए 1 के पृष्ठीय सबसे उपसमूह) के एक उप प्रकार में GFP अभिव्यक्ति ड्राइव PiggyBac की मध्यस्थता डीएनए स्थानांतरण प्रणाली – हम विशिष्ट बढ़ाने तत्वों, Cre / Lox सहित उपन्यास आनुवंशिक उपकरणों का उपयोग किया है. Axonal trajectories और डीए 1 एक्सोन का लक्ष्य विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में जल्दी और देर से भ्रूण चरणों में पीछा कर रहे हैं. इस रणनीति भ्रूण hindbrain में ब्याज की कोशिकाओं को निशाना बनाने के लिए और टीआरए के लिए उन्नत तकनीक का योगदान देता हैविकास के कई चरणों में सर्किट गठन cing.
Introduction
पश्चमस्तिष्क आरोही और neuronal नेटवर्क उतरते के माध्यम से मध्य और परिधीय तंत्रिका प्रणाली के बीच संवाद स्थापित करने से तंत्रिका तंत्र की एक प्रमुख रिले केंद्र का प्रतिनिधित्व करता है. यह श्वसन, चेतना, श्रवण, और मोटर समन्वय 1-3 सहित बुनियादी कार्यों को नियंत्रित करता है. जल्दी भ्रूण के विकास के दौरान, हड्डीवाला पश्चमस्तिष्क क्षणिक अलग neuronal सेल प्रकार का गठन किया और कई brainstem नाभिक केंद्रों 4 उत्पन्न कर रहे हैं, जिसमें दोहराव rhombomeres, में अपने पूर्वकाल पीछे (एपी) अक्ष के साथ विभाजित है. पश्चमस्तिष्क भी असतत neuronal progenitors निर्दिष्ट हो जाते हैं और अलग डीवी स्थानों में 3,5,6 अंतर है, जिस पर एक बेसल और बगली थाली, में अपने पृष्ठीय उदर (डीवी) अक्ष के साथ विभाजित है. जल्दी एपी और डीवी-विशिष्ट neuronal पैटर्न कार्यात्मक ब्रेनस्टेम circuitries की स्थापना के शासी कैसे हैं काफी हद तक अज्ञात है.
इस मौलिक पर ज्ञान प्राप्त करने के लिएसवाल, उपकरण जल्दी hindbrain में न्यूरॉन्स की विशिष्ट सबसेट लेबल करने के लिए और अधिक उन्नत चरणों में अपने axonal trajectories और कनेक्टिविटी का पता लगाने के क्रम में आवश्यक हैं. हम पहले से विशिष्ट बढ़ाने तत्वों का उपयोग किया, और जल्दी लड़की भ्रूण 7-9 में पृष्ठीय रीढ़ interneurons की axonal प्रक्षेपवक्र पर नज़र रखने के लिए एक Cre / LoxP आधारित सशर्त अभिव्यक्ति प्रणाली है. वर्तमान पांडुलिपि में हम पश्चमस्तिष्क निशाना बनाया और एक संशोधित इलेक्ट्रोपोरेशन रणनीति और PiggyBac का उपयोग कर, देर भ्रूण hindbrain interneurons, axons और उनके अन्तर्ग्रथनी लक्ष्य लेबलिंग के लिए प्रयोगात्मक प्रतिमान उन्नत किया है – मध्यस्थता डीएनए स्थानांतरण. हमारी नई रणनीति 2 करने के लिए 12 दिनों से hindbrain और उनके axonal अनुमानों और विभिन्न भ्रूण चरणों में synaptic स्थलों की ट्रैकिंग के एक पक्ष में अलग neuronal उपप्रकार की टैगिंग, electroporation के निम्नलिखित की अनुमति देता है. इस पद्धति के आधार पर हमने पश्चमस्तिष्क interneurons के पृष्ठीय सबसे उपसमूह (dA1/Atoh1 + लेबल </sऊपर> सेल) और दो contralateral आरोही axonal प्रक्षेपण पैटर्न से पता चला है, प्रत्येक एक अलग रज्जु अथवा रज्जु के सामन रचना में एक अलग एपी स्थान और elongates से निकला है. डीए 1 एक्सोन परियोजना और श्रवण नाभिक, मध्यमस्तिष्क में और सेरिबैलम 10 की कई परतों में फार्म synapses के लिए पाए गए.
लड़की electroporation के संयोजन, आनुवंशिक न्यूरॉन्स और विकास के अधिक उन्नत चरणों में प्रक्षेपण साइटों के विश्लेषण की ट्रेसिंग मस्तिष्क में neuronal नेटवर्क के गठन का अध्ययन करने के लिए और सर्किट के गठन को नियंत्रित करने वाले आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक अनूठा मंच प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
ओवो electroporation में लड़की के तंत्रिका तंत्र के विकास 20 के दौरान सेल विनिर्देश और axonal मार्गदर्शन की जांच के लिए एक व्यवहार्य, विश्वसनीय और प्रभावी उपकरण है. इस प्रोटोकॉल में हम विशिष्ट interneurons के सशर्त …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number |
| L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes | BTX, Harvard Apparatus | 45-0162 |
| pulse generator, ECM 830 | BTX, Harvard Apparatus | 45-0002 |
| OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 O.C.T. Compound |
| Nail Polish | From Any Commercial Supplier |
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