Comment les réseaux neuronaux sont établis dans le cerveau embryonnaire est une question fondamentale en neurobiologie développementale. Ici, nous avons combiné une technique d'électroporation avec des outils génétiques nouvelles, comme Cre / Lox-plasmides et le système de transposition ADN PiggyBac médiation dans le cerveau postérieur aviaire à étiqueter interneurones dorsale et suivre leurs projections axonales et des cibles synaptiques à différents stades de développement.
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Article de méthode
Électroporation de la Rhombencéphale tracer des trajectoires axonales et cibles synaptiques dans l'embryon de poulet
Dans cet article
Résumé
Résumé
Électroporation du tube neural embryonnaire poussin présente de nombreux avantages comme étant rapide et efficace pour l'expression de gènes étrangers dans des cellules neuronales. Dans ce manuscrit, nous proposons une méthode qui démontre unique façon d'électroporation d'ADN dans le cerveau postérieur aviaire à E2.75 pour étiqueter spécifiquement un sous-ensemble de progéniteurs neuronaux, et comment suivre leurs projections axonales et des cibles synaptiques à bien des stades avancés de développement, jusqu'à E14.5. Nous avons utilisé des outils génétiques nouveaux, y compris des éléments spécifiques enhancer, la CRE / Lox - Plasmides et que le système de transposition ADN PiggyBac médiation pour conduire l'expression de la GFP dans un sous-type de cellules du cerveau postérieur (la dorsale plus sous-groupe des interneurones, DA1). Trajectoires et les objectifs de dA1 axones axones sont suivis à des stades embryonnaires précoces et tardives à différentes régions du tronc cérébral. Cette stratégie contribue techniques avancées pour cibler des cellules d'intérêt dans le cerveau postérieur embryonnaire et pour tracement formation de circuit à plusieurs stades de développement.
Introduction
Le cerveau postérieur représente une plaque tournante du relais clé du système nerveux par la communication entre les systèmes nerveux central et périphérique via ascendant et descendant des réseaux neuronaux. Il régule les fonctions de base, y compris la respiration, la conscience, l'audition et la coordination motrice 1-3. Au cours du développement embryonnaire, le cerveau postérieur vertébré est subdivisé de manière transitoire le long de son axe antéro-postérieur (AP) dans rhombomères répétitifs, dans lequel les types de cellules neuronales distinctes sont formées et générer de multiples centres des noyaux du tronc cérébral 4. Le cerveau....
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Protocole
1. électroporation Rhombencéphale
1.1 manipulation des oeufs
- Placez les oeufs horizontalement dans un incubateur humidifié (37 à 38,5 ° C). Les embryons sont électroporation après 65-70 heures d'incubation, quand ils atteignent 16-17 (HH) stade (25-30 somites).
- Retirer les oeufs de l'incubateur, ils restent en position horizontale.
1.2 Préparatifs
- Tirez capillaires en verre (0,5 mm de diamètre).
- Connexion pliées en forme de L Genetrodes électrodes d'or (3 mm de diamètre) avec un support d'adaptateur sur le générateur d'impulsions. paramètres d'....
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Résultats
Ce protocole a été récemment utilisée pour découvrir les modèles axonales et les sites de projection de dA1 sous-groupe des interneurones dans le cerveau postérieur poussin 10. Pour étiqueter spécifiquement ces axones, un élément activateur (Atoh1), qui a déjà été qualifiée de spécifique pour la colonne vertébrale EL1 neurones 8,12,13, a été confirmée à exprimer en dA1 cellules cerveau postérieur 10. L'élément a été cloné en amont de la recombinase Cre et co-électroporation à E2.75 a.......
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Discussion
En électroporation in ovo est un outil réalisable, fiable et efficace pour examiner la spécification des cellules et le guidage axonal au cours de poussin développement du système nerveux 20. Dans ce protocole, nous décrivons un mode d'électroporation dans le cerveau postérieur de poulet à E2.75 utilisant des éléments amplificateurs qui permettent l'étiquetage conditionnelle des interneurones spécifiques. Cette stratégie est combiné avec le système de transposition PiggyBac médiation.......
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
Nous remercions le Dr Yuval Dror Gottlieb-pour l'illustration d'électroporation. Ce travail a été soutenu par des subventions à DSD de l'Institut national pour la psychobiologie en Israël et dans le programme de coopération Niedersachsen-Israël pour la recherche et par des subventions à AK de la Fondation Israël Science, le ministère israélien de la Santé et le Centre du Patrimoine Excellence-Legacy partenariat des sciences biomédicales.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Électrodes en or en forme de L Genetrodes 3 mm | BTX, Harvard Apparatus | 45-0162 | |
| Générateur d’impulsions, ECM 830 | BTX, Harvard Apparatus | 45-0002 | |
| OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 O.C.T. Vernis | |
| de n’importe quel fournisseur |
Références
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
- Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y.
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Réimpressions et autorisations
