Elektroporering av hindbrain att spåra axonal Trajectories och Synaptic Mål i Chick Embryo
Summary
Hur neuronala nätverk är etablerade i den embryonala hjärnan är en grundläggande fråga i utvecklingspsykologi neurobiologi. Här har vi kombinerat en elektro teknik med nya genetiska verktyg, såsom Cre / Lox-plasmider och piggyBac-medierad DNA införlivande systemet i aviär hindbrain att märka rygg interneurons och spåra sina axonal prognoser och synaptiska mål på olika utvecklingsstadier.
Abstract
Elektroporering av chick embryonala neuralröret har många fördelar såsom att vara snabb och effektiv för uttryck av främmande gener i neuronala celler. I detta manuskript ger vi en metod som visar entydigt hur man electroporate DNA i aviär hindbrain vid E2.75 i syfte att specifikt märka en delmängd av neuronala stamceller, och hur man kan följa sina axonal prognoser och synaptiska mål på mycket avancerade stadier av utveckling, upp till E14.5. Vi har använt nya genetiska verktyg inklusive specifika enhancerelement, Cre / Lox – baserade plasmider och piggyBac-medierad DNA införlivande systemet för att driva GFP uttryck i en subtyp av hindbrain celler (den dorsala mest undergrupp av interneuronen, DA1). Axonal banor och mål DA1 axoner följs på tidiga och sena embryonala stadier vid olika hjärnstammen regionerna. Denna strategi bidrar avancerade tekniker för att rikta celler av intresse för den embryonala hindbrain och för trasiering krets bildas på flera stadier av utveckling.
Introduction
Bakhjäman representerar en viktig relä navet i nervsystemet genom att kommunicera mellan de centrala och perifera nervsystemet via stigande och fallande neuronala nätverk. Det reglerar grundläggande funktioner, inklusive andning, medvetande, hörsel och motorik 1-3. Under tidig fosterutveckling, är ryggradsdjurens hindbrain transient uppdelad längs dess anterior-posterior (AP) axeln i repetitiva rhombomeres, där distinkta neuronala celltyper bildas och generera flera hjärnstammen kärnor centra 4. Bakhjäman är också uppdelad längs dess rygg-ventrala (DV) axeln i en basal och Alar plattan, där diskreta neuronala stamceller blir specificeras och differentiera i distinkta DV platser 3,5,6. Hur tidigt AP och DV-specifika neuronala mönster som styr inrättandet av funktionella hjärnstammen circuitries är i stort sett okända.
Att få kunskap om denna grundläggandeFrågan är verktyg som krävs för att märka specifika delmängder av nervceller i den tidiga hindbrain och att spåra deras axonal banor och anslutningsmöjligheter på högre stadier. Vi har tidigare utnyttjat specifika förstärkarelement, och en Cre / LoxP-baserat villkorligt uttryck system för att följa axonal bana dorsala spinal interneuronen i början kycklingembryo 7-9. I den aktuella manuskriptet vi har riktat bakhjäman och uppgraderade den experimentella paradigm för märkning sena embryonala hindbrain interneurons, axoner och deras synaptiska mål, med hjälp av en modifierad elektroporering strategi och piggyBac – medierad DNA införlivandet. Vår nya strategi tillåter taggning av distinkta neuronala subtyper i ena sidan av bakhjäman och spårning av deras axonal prognoser och synaptiska ställen vid olika embryonala stadier, från 2 upp till 12 dagar efter elektroporering. Baserat på denna metod, märkt vi den dorsal-mest undergrupp av hindbrain intemeuroner (dA1/Atoh1 + </sup> celler) och avslöjade två kontralaterala uppstigande axonal projektion mönster, härleder vardera från en annan AP plats och förlängs i en distinkt funiculus. DA1 axoner befanns projekt och synapser bildas i auditiva kärnor, mitthjärnan och i flera lager av lillhjärnan 10.
Kombinationen av chick elektroporation, genetisk spårning av nervceller och analys av projektion ställen vid mycket avancerade stadier av utveckling ger en unik plattform för att studera bildningen av neuronala nätverk i hjärnan och att klarlägga molekylära mekanismer som styr krets bildas.
Protocol
Representative Results
Discussion
I ovo elektroporering är en genomförbar, pålitligt och effektivt verktyg för att undersöka cell specifikation och axonal vägledning under chick nervsystemets utveckling 20. I detta protokoll beskriver vi ett läge av elektroporering i chick hindbrain vid E2.75 hjälp enhancerelement som möjliggör villkorliga märkning av särskilda interneurons. Denna strategi kombineras med piggyBac-medierad införlivande systemet sätta in främmande gener i chick-genomet, vilket möjliggör spårning av ax…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number |
| L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes | BTX, Harvard Apparatus | 45-0162 |
| pulse generator, ECM 830 | BTX, Harvard Apparatus | 45-0002 |
| OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 O.C.T. Compound |
| Nail Polish | From Any Commercial Supplier |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
- Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).
- Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136, 295-305 (2009).
- Lumsden, A. The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain. Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).
- Liu, Z., et al. Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor. J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).
- Muller, T., et al. The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord. Genes Dev. 19, 733-743 (2005).
- Avraham, O., et al. Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons. J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).
- Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4, 21 (2009).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), e1792 (2010).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain. J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).
- Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining. Stroke. 30, 1134-1141 (1999).
- Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37, e141 (2009).
- Wang, J., et al. piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella. Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).
- Leal-Ortiz, S., et al. Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis. J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).
- Gardzinski, P., et al. The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation. J. Physiol. 581, 75-90 (2007).
- Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).
- Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition. Neuron. 16, 487-500 (1996).
- Clarke, J. D., Lumsden, A. Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain. Development. 118, 151-162 (1993).
- Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo. J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).
- Marin, F., Puelles, L. Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei. Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
