المستمر الملاحظة المجهرية عالية الدقة من تنسخي الشيخوخة في الخميرة الناشيء.
Summary
نحن هنا وصف العملية من جهاز ميكروفلويديك الذي يسمح المستمر وعالية الدقة التصوير المجهري لخلايا الخميرة في مهدها واحد خلال تنسخي كاملة و / أو العمر الزمني.
Abstract
ونحن لشرح استخدام برنامج الإعداد ميكروفلويديك بسيطة، التي يمكن من خلالها تعقب خلايا الخميرة في مهدها واحدة طوال حياتها بأكملها. رقاقة ميكروفلويديك يستغل الفرق بين حجم الخلايا الأم وابنتها باستخدام مجموعة من micropads. عند تحميل، محاصرون الخلايا تحت هذه micropads، لأن المسافة بين micropad وغطاء زجاجي يشبه القطر من خلية الخميرة (3-4 ميكرون). بعد إجراء التحميل، يتم مسح مستنبت بشكل مستمر من خلال رقاقة، مما يخلق ليس فقط بيئة ثابتة ومحددة في كافة مراحل التجربة برمتها، ولكن أيضا الإحمرار خارج الخلايا الوليدة الناشئة، التي لا يتم الاحتفاظ تحت منصات نظرا لحجم أصغر بهم. الإعداد يحتفظ الخلايا الأم بكفاءة حتى أنه في تجربة واحدة تصل إلى 50 الخلايا الفردية يمكن رصدها بطريقة مؤتمتة بالكامل لمدة 5 أيام، إذا لزم الأمر، أو لفترة أطول. وبالإضافة إلى ذلك، الخصائص البصرية ممتازة للرقاقة تسمح عاليةالدقة التصوير من الخلايا أثناء عملية الشيخوخة بأكمله.
Introduction
تبرعم الخميرة هو كائن نموذجا هاما للشيخوخة البحوث 1. حتى دراسة مؤخرا تنسخي الشيخوخة في خلايا الخميرة كانت عملية شاقة تتطلب طريقة تشريح، في كل برعم التي تم إزالتها يدويا من الخلية الأم 2،3. لحل هذه المشكلة، قدمنا مؤخرا إعداد ميكروفلويديك رواية قادرة على تتبع الخلايا الأم الفرد طوال حياتهم بأكملها عمر 4.
في رقاقة لدينا ميكروفلويديك، محاصرون خلايا الخميرة تحت لينة micropads القائمة على المطاط الصناعي (انظر الشكل 1). استمرار تدفق المتوسطة يغسل بعيدا الخلايا الوليدة التي شكلت حديثا وتوفر الخلايا مع المواد المغذية الطازجة. في تجربة واحدة، وتصل إلى 50 خلية الأم يمكن رصدها بطريقة مؤتمتة بالكامل طوال حياتهم بأكملها تنسخي العمر. ويرجع ذلك إلى الخصائص البصرية ممتازة للرقاقة ميكروفلويديك، فمن الممكن لرصد الجوانب المختلفة في وقت واحد من بيولوجيا الخلايا الخميرة (على سبيل المثال </EM> باستخدام البروتينات الفلورية).
مقارنة لطريقة تشريح الكلاسيكية، والإعداد ميكروفلويديك يوفر مزايا كبيرة. فإنه يضمن بيئة محددة وثابتة خلال التجربة الشيخوخة كله. لا يتطلب أي معدات متخصصة مكلفة ويمكن تشغيلها على أي المجهر مجهزة التركيز الآلي وقدراتهم الوقت الفاصل بين وكذلك درجة الحرارة للسيطرة على زراعة الخلية. يمكن تعلم إنتاج وتشغيل رقائق ميكروفلويديك في غضون بضعة أيام. وبالإضافة إلى ذلك، الخلايا يمكن تحميلها مباشرة من تنامي ثقافة أضعافا مضاعفة، ميزة على طريقة أخرى نشرت مؤخرا ميكروفلويديك 5، الأمر الذي يتطلب biotinylation من الخلايا الأم. مجتمعة مع عالية الدقة والتصوير، والأسلوب هو موضح هنا يمكن أن تستخدم لقياس التغيرات التدريجية في التشكل الخلوي، بروتين تعبير والتوطين خلال الخميرة الشيخوخة على نحو غير مسبوق. القدرة علىيوفر الرصد على المدى الطويل من الخلايا واحد أيضا إمكانيات فريدة من نوعها للدراسات دورة الخلية الخميرة.
وقد تم تحسين هذه الطريقة مؤخرا على لإزالة biotinylation من البروتوكول 16، والتي نشرت في حين كان هذا المخطوط في الاستعراض.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة ميكروفلويديك الموصوفة هنا هو أداة هامة في رواية الشيخوخة البحوث، لأنها تتيح الجيل بسيطة ومؤتمتة من الخميرة تنسخي البيانات العمر في تركيبة مع استمرار ارتفاع القرار التصوير. هذه الصفات هي تحسينات كبيرة على مدى الإمكانات التجريبية للطريقة تشريح الكلاسيكية، ولك…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر Schippers لورا لكتابة النسخة الأولى من بروتوكول التحميل الخليوي وماركوس دي Goffau وجيلي Zampar لتسجيل الأشكال التضاريسية الميتوكوندريا.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass Petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22×40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012″ID x 0.030″OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030″ID x 0.090″OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22×40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E |
References
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. , (2012).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297 (2011).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).
- Defossez, P. A., et al. Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).
- Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding. Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).
- Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
