在芽殖酵母连续高分辨率显微观察复制性衰老
1Molecular Systems Biology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute,University of Groningen, 2Department for the Biology of Ageing, European Research Institute for the Biology of Ageing,University Medical Centre Groningen, University of Groningen, 3Institute of Biochemistry,ETH Zurich, 4Department of Health Sciences and Technology,ETH Zurich, 5Institute of Molecular Systems Biology,ETH Zurich
Summary
在这里，我们描述了一个完整的复制和/或按时间顺序寿命期间的单芽殖酵母细胞允许连续和高分辨率的显微成像的微流体装置的操作。
Abstract
我们展示了使用一个简单的微流控设置，单芽殖酵母细胞可以在其整个生命周期跟踪。利用微流控芯片使用数组micropads的母亲和女儿细胞之间的大小差异。在加载时，细胞下面这些micropads，被困的的micropad和盖玻璃之间的距离，因为类似的酵母细胞（3-4微米）的直径。的加载过程后，培养液中连续冲洗通过芯片，它不仅在整个实验中，创建一个常数和定义的环境，但也刷新新兴的子细胞，后者由于其更小的尺寸下面的焊盘不保留。设置如此有效地保留了母细胞，在一次实验中，最多50个单个单元格可以监测在一个完全自动化的方式，连续5天，或者，如有必要，更长。此外，该芯片的优异的光学性能允许高高分辨率成像在整个老化过程的细胞。
Introduction
芽殖酵母是一种重要的模式生物衰老研究1。直到最近，研究在酵母细胞中复制老龄化是一个艰苦的过程，需要解剖的方法，其中每个芽母细胞2,3手动删除。为了解决这个问题，我们最近提出了一种新的微流体设置能够跟踪个人母细胞在其整个寿命4。
在我们的微流控芯片，酵母细胞被困在软弹性micropads（ 见图1）。的连续流动的介质冲走新形成的女儿细胞，并提供新鲜的养分的细胞。在一次实验中，高达70母细胞可以监测在一个完全自动化的方式在其整个的复制寿命。由于微流体芯片的优异的光学性能，它可以同时监测不同方面的酵母细胞生物学（ 例如 </em>的使用荧光蛋白）。
古典夹层法相比，微流控的设置提供了巨大的优势。它确保了明确和稳定的环境下进行在整个老化实验。它不需要昂贵的专用设备，并可以运行在任何显微镜配备自动对焦和时间推移能力以及温度控制细胞培养。微流控芯片的生产和经营的，可以学到在几天之内。此外，细胞可以被直接加载从指数生长培养，另一个最近发表的微流控方法5，这需要母细胞的生物素化的优点在于比高分辨率成像，在这里描述的方法可以用来测量逐步改变一个结合在酵母细胞形态，蛋白质表达和定位以前所未有的方式老化。能力长期监测单细胞酵母细胞周期的研究也提供了独特的可能性。
最近一个这种方法已经被优化，去除生物素的协议，这是16时发布的这份手稿是在审查。
Protocol
1。硅片模具的生产和制备微流控芯片的创建软光刻模具生产的硅片。这些晶片可多次重复使用，以生产微芯片。可取的做法是执行各自的晶片的生产由一组专门在微流控6。 的晶片是由在两个步骤的光刻工艺，使用两种不同的负光致抗蚀剂层，SU-8 7。底部层是用来产生细胞俘获区（SU-8，2002;高度3-4微米），而频道与顶层（SU-8 2010，高度为10…
Representative Results
在这个协议中，细胞被装入微流控芯片，直接从指数中的文化。被困在微流控芯片的细胞的年龄分布，以确定是否是类似文化装货前，细胞染色小麦凝集素结合FITC（WGA-FITC）可视化芽痕。在图3中可以看出，细胞包封微流体芯片micropads下不偏细胞的目标年龄。 自我复制的寿命可以简单地确定计数芽是由一个单一的母细胞的数量。此数据被变换成的寿命曲线绘制的?…
Discussion
这里所描述的微流体方法是一个重要的新工具，在老龄化的研究，因为它使酵母复制寿命数据相结合的简单和自动化生成连续的高分辨率成像。这些属性是经典的夹层法在实验的可能性的重大改进，但需要加以考虑的方法，该方法也有一些局限性。
请注意，所确定的复制寿命可受保留母细胞：下micropad保存的每一个细胞的效率有一定概率被冲刷掉从芯片（ 例如相邻小?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们想感谢劳拉写的第一个版本的细胞装入协议和马库斯Goffau的和吉尔Zampar的为得分王线粒体形态Schippers。
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass Petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22×40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012″ID x 0.030″OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030″ID x 0.090″OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22×40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E |
References
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. , (2012).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297 (2011).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).
- Defossez, P. A., et al. Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).
- Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding. Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).
- Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
Citer Cet Article
Huberts, D. H. E. W., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (78), e50143, doi:10.3791/50143 (2013).