תצפית מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה מתמשכת של replicative הזדקנות בשמרי הנצה
Summary
אנו מתארים כאן את הפעולה של מכשיר microfluidic המאפשר הדמיה מיקרוסקופית רציפה ורזולוציה גבוהה של תאי שמרי ניצנים בודדים במהלך replicative המלא ו / או תוחלת החיים כרונולוגית.
Abstract
אנו מדגימים את השימוש בהתקנת microfluidic פשוט, שבו ניתן לעקוב אחר תאי שמרי ניצנים בודדים לאורך כל תוחלת החיים שלהם. שבב microfluidic מנצל את ההבדל בגודל בין תאים אם ובתה באמצעות מערך של micropads. לאחר הטעינה, תאים לכודים מתחת micropads אלה, משום שהמרחק בין micropad ומכסה הזכוכית דומה לקוטר של תא שמרים (מיקרומטר 3-4). לאחר הליך הטעינה, תרבות בינונית הוא הסמיק ברציפות באמצעות השבב, שיוצר סביבה קבועה ומוגדרת לא רק לאורך כל הניסוי, אלא גם את החום מתפתחים התאים בת, שאינם נשמרים מתחת לרפידות עקב הגודל הקטן שלהם. ההתקנה שומרת תאי אמא כל כך יעילה, כי בניסוי אחד יכולים להיות במעקב עד 50 תאים בודדים באופן אוטומטי לחלוטין למשך 5 ימים או, במידת צורך, זמן רב יותר. בנוסף, את התכונות האופטיות מעולות של השבב תאפשר גבוהותרזולוציה הדמיה של תאים במהלך תהליך ההזדקנות כולו.
Introduction
ניצני שמרים הוא אורגניזם מודל חשוב לחקר הזדקנות 1. עד לאחרונה לומד replicative הזדקנות בתאי שמרים היה תהליך מייגע הדורש נתיחת שיטה, שבה כל ניצן הוסר באופן ידני מהתא האם 2,3. כדי לפתור בעיה זו, אנו הצגנו לאחרונה התקנת microfluidic רומן מסוגלת לעקוב אחר תאי אמא בודדים לאורך כל תוחלת החיים שלהם 4.
בשבב microfluidic שלנו, תאי שמרים לכודים תחת micropads מבוסס אלסטומר הרך (ראה איור 1). זרימה רציפה של מדיום שוטפת חדש שנוצרו תאי בת ומספקת את התאים עם חומרים מזינים טריים. בניסוי אחד, יכולים להיות במעקב עד 50 תאים האם באופן אוטומטי לחלוטין לאורך כל replicative תוחלת החיים שלהם. בשל תכונות האופטיות מעולות של שבב microfluidic, ניתן לפקח בו זמנית היבטים שונים של ביולוגיה של תא שמרים (למשל </em> באמצעות חלבוני ניאון).
בהשוואה לשיטה הקלסית לנתיחה, התקנת microfluidic מספקת יתרונות משמעותיים. זה מבטיח סביבה מוגדרת וקבועה במשך כל ניסוי ההזדקנות. זה לא דורש ציוד מיוחד ויקר ניתן להריץ על כל מיקרוסקופ מצויד בפוקוס אוטומטי ויכולות זמן לשגות כמו גם טמפרטורת בקרה לגידול תאים. הייצור והתפעול של שבבי microfluidic ניתן ללמוד תוך כמה ימים. בנוסף לכך, תאים ניתן לטעון ישירות מתרבות גדלה באופן אקספוננציאלי, יתרון על פני שיטה אחרת שפורסמה לאחרונה microfluidic 5, אשר דורשת biotinylation של תאים האם. בשילוב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה, בשיטה שתוארה כאן יכולה לשמש למדידת שינויים הדרגתיים במורפולוגיה תאית, ביטוי חלבון ולוקליזציה בשמרי ההזדקנות באופן חסר תקדים. היכולת לניטור ארוך טווח של תאים בודדים גם מספק אפשרויות ייחודיות ללימודי מחזור תא שמרים.
שיטה זו מזמן כבר מותאמת להסיר biotinylation מ16 הפרוטוקול, שפורסם בעת כתב היד הזה היה בביקורת.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת microfluidic המתוארת כאן היא כלי חשוב בתהליך הזדקנות רומן מחקר כפי שהיא מאפשרת יצירה פשוטה והאוטומטית של נתוני תוחלת החיים replicative שמרים בשילוב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה מתמשכת. תכונות אלה הן שיפורים משמעותיים על פני האפשרויות הניסיוניות של השיטה הקלסית לנתיחה, עדיין ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לSchippers לורה לכתיבה את גירסאות הראשונות של תא טעינת הפרוטוקול ומרקוס דה Goffau וגיי Zampar עבור מניה המורפולוגיות המיטוכונדריה.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass Petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22×40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012″ID x 0.030″OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030″ID x 0.090″OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22×40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E |
References
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. , (2012).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297 (2011).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).
- Defossez, P. A., et al. Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).
- Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding. Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).
- Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
