出芽酵母の老化複製の連続高分解能顕微鏡観察
Summary
ここではそれらの完全な複製および/または時系列の寿命の間に単一の出芽酵母細胞の連続的かつ高分解能顕微鏡イメージングを可能にするマイクロ流体装置の動作を説明する。
Abstract
我々は、単一出芽酵母細胞は、それらの全体の寿命にわたって追跡することができるという簡単なセットアップマイクロ流体の使用を実証する。マイクロ流体チップはmicropadsの配列を使用して母と娘細胞間の大きさの違いを利用する。 micropadとカバーガラスとの間の距離は、酵母細胞（3-4ミクロン）の直径に類似しているため、ロード時に、細胞は、これらのmicropadsの下に閉じ込められている。ローディング手順の後、培地を継続的に小さいサイズのためにパッドの下に保持されない新興の娘細胞、うち定数と定義された実験全体を通して環境だけでなく、フラッシュを作成するだけでなく、チップを通してフラッシュされます。セットアップはとても効率的に50個々の細胞まで、単一の実験では5日の完全に自動化された方法で監視されたり、必要であれば、長くすることができ母細胞を保持します。また、チップの優れた光学特性が高いことができ全体の老化のプロセスの間に細胞の分解能イメージング。
Introduction
出芽酵母は、研究1のエージングのための重要なモデル生物である。最近、酵母細胞の老化複製を勉強するまで、各芽を手動母細胞2,3から削除された解剖の方法を必要とする骨の折れるプロセスであった。この問題を解決するために、我々は、最近、それらの全体の寿命にわたって4個々の母細胞を追跡することができる新規なマイクロ流体セットアップを提示した。
我々のマイクロ流体チップでは、酵母細胞は、エラストマーベースのソフトmicropads（ 図1参照）の下に閉じ込められている。媒体の連続的な流れは、離れて、新たに形成された娘細胞を洗浄し、新鮮な栄養素を細胞を提供する。単一の実験では、最大50の母細胞は、彼らの全体の複製寿命を通して完全に自動化された方法で監視できます。マイクロ流体チップの優れた光学的性質のために、それは同時に、酵母細胞生物学のさまざまな側面（ 例えば、監視することが可能である</em>の蛍光タンパク質）を用いて。
古典的な解剖の方法に比べ、マイクロ流体セットアップはかなりの利点を提供します。それは全体の高齢化実験中に定義された、一定の環境を確保します。それは高価な特殊な機器を必要とせず、自動焦点と時間経過の能力だけでなく、細胞培養のための温度制御を搭載した任意の顕微鏡上で実行することができます。マイクロ流体チップの生産と操作は数日以内に学習することができる。さらに、細胞が対数増殖期培養直接、母細胞のビオチン化を必要とする別の最近公開されたマイクロ流体法5、以上の利点からロードすることができる。高分解能イメージング、ここに記載した方法と組み合わせることで徐々に変化を測定するために使用することができる細胞形態では、酵母中のタンパク質の発現および局在は前例のない方法で老化。のための能力単一細胞の長期モニタリングはまた、酵母細胞周期の研究のためのユニークな可能性を提供する。
この方法は、最近、この原稿が審査に入ったままの状態で公開されたプロトコル16から、ビオチンを除去するために最適化されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明したマイクロ流体の方法は、それが継続的な高分解能イメージングとの組み合わせで酵母複製寿命データのシンプルかつ自動生成を可能にするような研究を老化の重要な新しいツールです。これらの属性は、古典的な解剖法の実験的な可能性の上に大きな改善ですが、まだ考慮する必要がある方法のいくつかの制限があります。
micropad下に保持し、すべての?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ミトコンドリアの形態を達成すると、セル負荷プロトコルとマーカス·デGoffauとGuille Zamparの最初のバージョンを作成するためのローラのシッパーズに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass Petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22×40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012″ID x 0.030″OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030″ID x 0.090″OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22×40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E |
References
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