증식하는 연속 고해상도 현미경으로 관찰 신진 효모의 노화
Summary
우리는 여기에서 자신의 완전한 증식하는 및 / 또는 연대순 수명 기간 동안 하나의 신진 효모 세포의 연속 고해상도 현미경 이미징을 허용 microfluidic 장치의 동작을 설명합니다.
Abstract
우리는 단 하나 싹 트는 효모 세포가 자신의 전체 수명에 걸쳐 추적 할 수있는 간단한 미세 설정의 사용을 보여줍니다. 미세 유체 칩은 micropads의 배열을 사용하여 어머니와 딸 세포 사이의 크기 차이를 이용합니다. micropad 및 커버 유리 사이의 거리가 효모 세포 (3-4 μm의)의 직경과 비슷하기 때문에로드 할 때, 세포는, 이러한 micropads 아래에 갇혀있다. 로딩 과정을 거친 후, 배양액을 연속적으로 그들의 작은 크기로 인해 패드 아래에 유지되지 않습니다 새로운 딸 세포 밖으로 플러시 또한 전체 실험을하는 동안 상수 정의 환경을 만들어뿐만 아니라 칩을 통해 플러시되지만. 설정은 하나의 실험에서 50까지 각각의 세포가 더 필요한 경우 5 일 동안 완전 자동화 된 방식으로 모니터링하거나 할 수 있도록 효율적으로 어머니 세포를 유지합니다. 또한, 칩의 우수한 광학 특성은 높은 수전체 노화 과정에서 세포의 고해상도 영상.
Introduction
효모 신진은 연구 1 노화에 대한 중요한 모델 생물이다. 최근 효모 세포 노화 증식하는 공부를 할 때까지 각각의 봉오리를 수동으로 어머니 세포 2,3에서 제거하는, 해부 방법을 필요로하는 힘든 과정이었다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 최근 자신의 전체 수명 4를 통해 각각의 어머니 세포를 추적 할 새로운 마이크로 유체 설치를 발표했다.
우리의 마이크로 유체 칩, 효모 세포는 (그림 1 참조) 부드러운 탄성 중합체 기반 micropads 아래에 갇혀있다. 매체의 지속적인 흐름이 떨어져 새로 형성 딸 세포를 세척하고 신선한 영양소와 세포를 제공합니다. 한 실험에서 50까지 어머니 세포는 그들의 전체 증식하는 수명에 걸쳐 완전 자동화 된 방식으로 모니터링 할 수 있습니다. 미세 유체 칩의 우수한 광학 특성으로 인해, 그것은 동시에 효모 세포 생물학의 다양한 측면 (예를 들어 모니터링 할 수 있습니다 </EM> 형광 단백질)를 사용하여.
고전적인 절개 방법에 비해 미세 설정은 상당한 이점을 제공합니다. 그것은 전체 노화 실험 기간 동안 정의 및 지속적인 환경을 보장합니다. 그것은 고가의 전문 장비를 필요로하지 않고 자동 초점과 시간 경과 능력을 가지고뿐만 아니라 온도 제어 세포 재배되어 어떤 현미경에서 실행할 수 있습니다. 미세 유체 칩의 생산 작업은 몇 일 이내에 배울 수 있습니다. 또한, 세포는 주로 기하 급수적으로 증가 문화, 어머니 세포의 biotinylation을 필요로하는 다른 최근 발표 된 미세 방법 5에 비해 이점에서로드 할 수 있습니다.은 여기에 설명 된 방법은 점진적인 변화를 측정하는 데 사용할 수있는 고해상도 이미지와 결합 세포 형태에서, 효모 동안 단백질 발현 및 현지화은 전례없는 방식으로 노화. 의 기능단일 세포의 장기 모니터링은 또한 효모 세포주기 연구에 대한 독특한 가능성을 제공합니다.
이 방법은 최근에이 원고 검토에있는 동안 출판 된 프로토콜 16에서 biotinylation을 제거하는 최적화되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 미세 메서드는 지속적으로 높은 해상도 이미지와 함께 효모 증식하는 수명 데이터를 간단하고 자동 생성을 가능으로 노화 연구에 중요한 새로운 도구입니다. 이러한 특성은 고전적인 절개 방법의 실험 가능성에 큰 개선이다, 그러나 고려해야하는 방법의 몇 가지 제한이 있습니다.
micropad에서 보관 모든 셀 (이웃 세포의 신진 셀 예를 들어 그것을 멀리 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 미토콘드리아 형태학을 기록 세포 로딩 프로토콜과 마커스 드 Goffau 및 인 Guille Zampar의 첫 번째 버전을 작성하기위한 로라 Schippers에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass Petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22×40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012″ID x 0.030″OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030″ID x 0.090″OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22×40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E |
References
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. , (2012).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297 (2011).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).
- Defossez, P. A., et al. Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).
- Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding. Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).
- Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
