Kontinuerlig Högupplöst mikroskopisk observation av Replikativ Aging i knoppande jäst
Summary
Vi beskriver här funktionen av en mikrofluidikanordning som möjliggör kontinuerlig och hög upplösning mikroskopisk avbildning av enstaka spirande jästceller under deras avslutade replikativa och / eller kronologisk livslängd.
Abstract
Vi visar användningen av en enkel mikroflödessystem setup, där enstaka spirande jästceller kan spåras under hela deras livslängd. Den mikroflödessystem chip utnyttjar skillnaden i storlek mellan mor och dotter celler med en rad micropads. Vid lastning, celler fastnar under dessa micropads, eftersom avståndet mellan micropad och täckglaset liknar diametern hos en jästcell (3-4 | im). Efter lastning förfarande är odlingsmedium kontinuerligt spolas genom chip, vilket inte bara skapar en konstant och definierad miljö under hela försöket, men också spolar ut de nya dotterceller, som inte fångas under dynorna på grund av sin storlek. Installationsprogrammet behåller moderceller så effektivt att i ett enda experiment upp till 50 individuella celler kan övervakas på ett helt automatiserat sätt under 5 dagar eller, om nödvändigt, längre. Dessutom, de utmärkta optiska egenskaperna hos chipet medge en högUpplösning avbildning av celler under hela åldrandeprocessen.
Introduction
Knoppande jäst är en viktig modell organism för äldreforskning 1. Tills nyligen studera replikativa åldrandet i jästceller var en arbetsam process som kräver en dissektion metod, i vilken varje knopp manuellt avlägsnades från modercellen 2,3. För att lösa detta problem, presenterade vi nyligen en ny microfluidic inställning kunna spåra enskilda mor celler under hela deras livslängd 4.
I vår microfluidic chip, är jästceller instängda under mjuka elastomer-baserade micropads (se figur 1). Ett kontinuerligt flöde av mediet tvättar bort nybildade dotterceller och ger cellerna med färska näringsämnen. I ett enda experiment, kan upp till 50 Mor celler övervakas på ett helt automatiserat sätt hela deras replikationsförmåga livslängd. På grund av de utmärkta optiska egenskaperna hos microfluidic chip, är det möjligt att samtidigt övervaka olika aspekter av jäst cellbiologi (t.ex. </em> med hjälp av fluorescerande proteiner).
Jämfört med den klassiska dissekeringsmetod ger mikroflödessystem installationen väsentliga fördelar. Det garanterar en bestämd och konstant miljö under hela åldring experimentet. Det kräver ingen dyr specialutrustning och kan köras på alla mikroskop utrustat med automatisk fokus och tidsförlopp förmågor samt temperatur-kontroll för cellodling. Produktion och drift av de mikroflödessystem marker kan läras inom några dagar. Dessutom kan celler direkt laddas från en exponentiellt växande kultur, en fördel över en annan nyligen publicerad mikroflödessystem metod 5, som kräver biotinylering av moderceller. Kombinerat med högupplöst avbildning, den här beskrivna förfarandet kan användas för att mäta gradvisa förändringar en i cellulär morfologi, protein uttryck och lokalisering under jäst åldrande i ett aldrig tidigare skådat sätt. Möjligheten tilllångsiktig övervakning av enskilda celler ger också unika möjligheter till cykel jästcellens studier.
a Denna metod har nyligen optimerats för att avlägsna biotinyleringen ur protokoll 16, som publicerades samtidigt som detta manuskript var i recensionen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mikroflödessystem metod som beskrivs här är ett viktigt nytt verktyg i forskningen kring åldrandet eftersom det möjliggör enkel och automatisk generering av livslängd jäst replikativa data i kombination med fortsatt hög upplösning. Dessa attribut är viktiga förbättringar under de experimentella möjligheterna för den klassiska dissekeringsmetod, men det finns några begränsningar av den metod som måste beaktas.
Notera att den bestämda replikativa livslängd kan påverkas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Laura Schippers för att skriva de första versionerna av cellbelastning protokollet och Marcus de Goffau och Guille Zampar för att ha dödat mitokondriella morfologier.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass Petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22×40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012″ID x 0.030″OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030″ID x 0.090″OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22×40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E |
References
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. , (2012).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297 (2011).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).
- Defossez, P. A., et al. Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).
- Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding. Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).
- Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).
