Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em> Drosophila</em> Embryogenèse

Summary

Nous décrivons ici une méthode efficace pour étudier la dynamique de la clairance des cellules apoptotiques<em> In vivo</em>. Cette méthode emploie vivre<em> Drosophila</em> Embryons comme un modèle puissant pour la surveillance phagocytose des cellules apoptotiques en utilisant un marquage spécifique des cellules apoptotiques et les phagocytes.

Abstract

L'élimination correcte des cellules indésirables ou aberrante par apoptose et la phagocytose ultérieure (clairance cellulaire par apoptose) est cruciale pour le développement normal chez tous les organismes pluricellulaires. Clairance cellulaire par apoptose est un processus hautement dynamique, intimement associée à la mort cellulaire, les cellules apoptotiques unengulfed sont à peine vus in vivo dans des conditions normales. Afin de comprendre les différentes étapes de dégagement des cellules apoptotiques et de comparer les phagocytes «professionnels» – les macrophages et les cellules dendritiques de «non-professionnel» – cellules voisines tissu-résidents, l'imagerie in vivo en direct du processus est extrêmement précieux. Ici, nous décrivons un protocole pour l'étude de clairance des cellules apoptotiques dans les embryons de drosophile en direct. Pour suivre la dynamique des différentes étapes de la phagocytose que nous utilisons marqueurs spécifiques des cellules apoptotiques et les phagocytes. En outre, nous pouvons surveiller deux systèmes phagocyte en parallèle: les macrophages «professionnels» et «semi-profeglie ssional »dans le système nerveux central en développement (SNC). La méthode décrite ici utilise l'embryon de drosophile comme un excellent modèle pour l'étude en temps réel de la clairance des cellules apoptotiques.

Introduction

L'élimination correcte des cellules indésirables ou aberrante par apoptose et la phagocytose ultérieure est crucial pour le développement embryonnaire ainsi que pour l'homéostasie tissulaire chez l'adulte. Phagocytose des cellules apoptotiques ou l'autorisation cellulaire par apoptose est un processus très dynamique qui se déroule en quatre étapes: (1) le recrutement de phagocytes à la cellule apoptotique («Trouvez-moi»), (2) la reconnaissance de la cellule comme une cible pour la phagocytose ( «eat-me») et (3) l'engloutissement, suivi par (4) maturation du phagosome et de la dégradation de la particule apoptotique ^1-5. Il existe deux types de phagocytes: macrophages «professionnels» et les cellules dendritiques immatures, et le «non-professionnels» les cellules voisines tissu-résidents, qui sont cruciales pour le dédouanement des cellules apoptotiques pendant métazoaires développement ^6,7.

En développement chez la drosophile, l'élimination des cellules superflues par apoptose se produit dans trois mphases Ain, d'abord dans le milieu à la fin embryon, puis au milieu chrysalide, puis de nouveau au début des adultes. Au cours de l'embryogenèse particules apoptotiques sont éliminés par les phagocytes «professionnels», les macrophages et les cellules gliales par ectoderme et ^8,9 «non-professionnel».

Dans nos précédents travaux, nous avons identifié un récepteur phagocytaire, Six-microns-sous (SIMU), qui est exprimé exclusivement dans les cellules phagocytaires cours de l'embryogenèse. En utilisant le promoteur simulation, nous avons généré un marqueur spécifique des populations de cellules phagocytaires (simu-cytGFP) qui nous permet de suivre les macrophages, les cellules gliales ectoderme et simultanément dans un embryon en développement Live ^8. En outre, en utilisant des marqueurs spécifiques des cellules apoptotiques dans les différentes étapes de l'apoptose, nous sommes en mesure de suivre la dynamique de dégagement cellulaire par apoptose in vivo.

Protocol

Pour suivre la dynamique de l'élimination des cellules apoptotiques in vivo deux populations de cellules doivent être étiquetés: les cellules phagocytaires et les cellules apoptotiques. Pour marquer des populations de cellules phagocytaires nous utilisons une ligne Drosophila contenant le marqueur simu-cytGFP, qui marque les cellules phagocytaires exclusivement dans l'embryon: les macrophages, les cellules gliales et de l'ectoderme 8. On …

Representative Results

images représentatives d'un film dans lequel les cellules apoptotiques sont étiquetés avec l'annexine V et cellules gliales, ectoderme et les macrophages sont étiquetés avec simu-cytGFP sont présentés dans la figure 2. Chaque image est une projection de 3 tranches de 2 um chacun. L'embryon de l'étape 15 est correctement positionné montrant le SNC embryonnaire dans le milieu de la glie bien étiquetés (g). Macrophages (M), qui sont pour la p…

Discussion

Clairance cellulaire par apoptose est une dernière étape critique de l'apoptose, qui est hautement dynamique. Par conséquent études en temps réel du processus sont d'une importance capitale. Nous décrivons ici un protocole qui permet la surveillance de la clairance des cellules apoptotiques dans le développement des embryons de drosophile vivre. Dans cette procédure, deux populations de cellules doivent être marqués à l'aide de marqueurs spécifiques: les cellules apoptotiques et les phag…

Materials

			Reagent
Annexin V	Molecular Probes	A35108
PhiPhiLux G2D2	OncoImmunin	A304R2G-5
LysoTracker	Molecular Probes	L-7528
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898
			Material
Capillary tubing	FHC	30-30-0
Cell Strainer	SPL	93100
Paintbrush