Polarized मानव airway के एक तरल से ढके संस्कृति की स्थापना उपकला Calu 3 मेजबान सेल श्वसन रोगज़नक़ों रिस्पांस कोशिकाओं के अध्ययन<em> इन विट्रो में</em

Summary

इस रिपोर्ट में निष्कर्ष और निष्कर्ष उन लेखकों की हैं और रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र के विचार जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व.

Abstract

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.

Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult¹, pharmacological compounds^2-6, and bacterial^7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome – associated coronavirus^10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE^15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.

To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments^17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 Ω×cm², Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Protocol

1. उपयोग के लिए Transwell संस्कृतियों में संवर्धन Calu 3 कोशिकाओं सुरक्षा उपाय: बाँझ संस्कृति तकनीक का उपयोग कर एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन. पिघलना के जमे हुए भंडारण से कोशिकाओं ईगल न्यूनतम आवश्यक 20% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय (FBS) सीरम, 0.1 मिमी गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 2 मिमी एल glutamine, and10 मिमी HEPES 7.4 पीएच (EMEM 20 +% S) युक्त मध्यम तैयार. बाँझ फिल्टर तैयार एक 0.2 सुक्ष्ममापी ताकना आकार फिल्टर का उपयोग कर मध्यम, और एक पानी के स्नान में गर्म 37 के लिए डिग्री सेल्सियस स्वस्थानी airway उपकला वातावरण में अधिक को प्रतिबिंबित करता हो, मध्यम एंटीबायोटिक दवाओं या antimycotics के साथ पूरक है. पिघलना के एक 37 डिग्री सेल्सियस नहाने के पानी में एक Calu तीन तेजी से कोशिकाओं (<1 मिनट) के जमे हुए cryovial. एक 50 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार ट्यूब thawed कोशिकाओं स्थानांतरण और गर्म EMEM-20% + एस के 30 मिलीलीटर जोड़ें गोली centrifugation द्वारा 1,000-1,200 में 5 मिनट के लिए कोशिकाओं × छ,प्रशीतन बिना, और कम रुद्धगति के साथ. तैरनेवाला धीरे पसाना और धीरे से ऊपर pipetting और नीचे गर्म EMEM 20 +% S के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend. बीज 2 से 5 × 10 6 6 अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति की थाली और सेते में अच्छी तरह से प्रति 37 कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस, हवा वातावरण में 7% सीओ 2 तक कोशिकाओं को 75% -80% सहधारा. दैनिक जाँच करें, अप करने के लिए सात दिनों की आवश्यकता हो सकती है. हर 3-4 दिनों कोशिकाओं से मध्यम aspirate और यह ताजा EMEM-20% + एस के साथ बदलें Subculture कोशिकाओं: गर्म 0.05% trypsin – एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 0.02% EDTA. कोशिकाओं से मध्यम Aspirate, और कोशिकाओं को गर्म 0.05% trypsin के साथ एक बार धो – EDTA 0.02% अतिरिक्त मध्यम और सीरम हटा. धोने निकालें और कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से प्रति गरम trypsin के 1 मिलीलीटर जोड़ने. 37 पर सेते डिग्री सेल्सियस और 7% सीओ 2 और एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं के कम से कम 75% की अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट (ओं) से अलग जब तक हर 5 मिनट की निगरानी. इस साल मई में5 और 30 मिनट के बीच ले. EMEM 20 +% S में कोशिकाओं को धोने के लिए अतिरिक्त trypsin हटाने. एक 50 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार ट्यूब trypsinized कोशिकाओं में स्थानांतरित. एक संस्कृति 6 अच्छी तरह से थाली से कोशिकाओं के कई कुओं एक 50 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में जमा किया जा सकता है. प्रशीतन बिना 1,000-1,200 पर EMEM-20% + एस और गोली centrifugation द्वारा कोशिकाओं के 30 मिलीग्राम × छ, जोड़ें, और कम रुद्धगति के साथ. तैरनेवाला धीरे पसाना और ताजा EMEM 20 +% S में धीरे से ऊपर pipetting और नीचे कोशिकाओं resuspend. 1.2.1 1.2.3 ऊपर के माध्यम से कदम का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं trypsinize, टिशू कल्चर व्यंजन में subculture कोशिकाओं को जारी रखने के रूप में 1.2.7 के माध्यम से 1.2.5 चरणों में वर्णित है जब वे 75 के बीच कर रहे हैं – 80% सहधारा. Subculture से एक 6-अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से एक से एक T-25 सेमी का EMEM-20% + S 5 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में 2 फ्लास्क, 0.5 से 1 × 10 6 कोशिकाओं / फ्लास्क के बीच बोने. 5 मिलीग्राम का उपयोग T-25 सेमी 2 फ्लास्क प्रति trypsin गरम कोशिकाओं subculture अलगएक सेमी T-25 दो कुप्पी से एक के लिए T-75 EMEM 20 +% S के 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में 2 सेमी फ्लास्क, बोने के बीच 1 से 5 × 10 6 कोशिकाओं / फ्लास्क. 8 मिलीग्राम का उपयोग T-75 सेमी 2 फ्लास्क प्रति trypsin गरम एक T-75 सेमी फ्लास्क 2 से 2 T-75 सेमी 2 बोतल में कोशिकाओं subculture, अलग. 3 नए बोतल: इष्टतम सेल के विकास के लिए, subculture कोशिकाओं टी 75 2 1 माता पिता फ्लास्क से अधिक अनुपात में या सेमी subculture से भी बड़ा बोतल में नहीं करते हैं. एक बार कोशिकाओं subcultured किया गया है, पूरी तरह से हटाने और मध्यम की जगह हर 2 से 3 दिनों तक वे 75-90% संगम तक पहुँचने. कोशिकाओं को तीन सप्ताह के लिए लेने के लिए 75-90% संगम तक पहुंच सकता है. Polarized संस्कृतियों, subculture कोशिकाओं से पहले वे एक monolayer के रूप में 90% संगम आगे बढ़ने का इष्टतम पीढ़ी के लिए. Subculture कोशिकाओं को जारी रखें जब तक बीज के लिए पर्याप्त कक्षों संख्या Transwell आवेषण के वांछित हो गए हैं. प्रत्येक Transwell डालने 2 10 × 5 कोशिकाओं की आवश्यकता. अनुकूलतम प्रदर्शन polarized संस्कृतियों पैदा करने के लिए, कोशिकाओं है कि कोई 10 से अधिक subcultures आया है का उपयोग करें. 2. बढ़ रहा है Polarized Calu 3 तरल से ढके संस्कृति (एलसीसी) सुरक्षा उपाय: बाँझ संस्कृति तकनीक का उपयोग कर एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन. 37 के लिए एक पानी स्नान में EMEM 10% (%-10 EMEM) FBS और गर्म युक्त तैयार डिग्री सेल्सियस एक 24 अच्छी तरह से बोने के लिए Transwell थाली तैयार है. बाँझ संदंश का प्रयोग, डालने झिल्ली छूने के बिना थाली के इंटीरियर से बाहरी पंक्तियों को Transwell आवेषण कदम. सेल केवल प्लेट के बाहरी पंक्तियों पर कुओं में subcultured जा चाहिए. हवा के बुलबुले के basolateral डिब्बों में शुरूआत को रोकने के लिए, प्रत्येक डिब्बे की दीवार के खिलाफ विंदुक angling और धीरे धीरे कुएं में मध्यम को रिहा करके हर एक के लिए EMEM-10% की 600 μl जोड़ें. T-75 सेमी 2 ऊतक से कोशिकाओं को अलग करें. SubcuLTURE बोतल गरम trypsin का उपयोग कर रहे हैं, और EMEM 20 +% trypsinized कोशिकाओं, के रूप में 1.2 चरण में वर्णित के हर 2 बोतल प्रति 30 मिलीलीटर में धो. EMEM-10% के 5 मिलीलीटर में अच्छी तरह से धीरे से ऊपर pipetting और नीचे धोया कोशिकाओं resuspend. Trypan नीले अपवर्जन विधि से व्यवहार्य और कुल कोशिका की गिनती का निर्धारण करते हैं. आगे बढ़ें तो केवल 80% – 90% व्यवहार्य हैं. एक 50 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में 2 × 10 6 व्यवहार्य EMEM-10% के साथ कोशिकाओं / मिलीलीटर की एक एकाग्रता के लिए कोशिकाओं को पतला. प्रत्येक Transwell के शिखर डिब्बे कोशिकाओं जोड़ें. कुओं A1 और D1, जो सेल से मुक्त नियंत्रण कुओं, कि, कारतूस है, कोशिकाओं के बिना EMEM-10% की 100 μl जोड़ने के लिए किया जाएगा. शेष कुओं में से प्रत्येक के लिए, resuspended Calu 3 कोशिकाओं के 100 μl जोड़ने के लिए, धीरे डालने के दीवार के आंतरिक गाइड चैनल के खिलाफ विंदुक angling और धीरे धीरे कोशिकाओं को रिहा. विंदुक डालने झिल्ली के लिए स्पर्श मत करो. Calu तीन कोशिकाओं के एक सजातीय निलंबन को बनाए रखने के लिए, धीरे सेल निलंबन को उत्तेजित करना हैइस बोने चरण के दौरान. सेते हैं 37 डिग्री सेल्सियस और 7% हवा वातावरण में सीओ 2 Transwell थाली. एक मशीन में जगह प्लेट जहां शारीरिक अशांति कम हो जाएगा. ध्रुवीकरण की दक्षता में सुधार करने के लिए, प्लेटें एक दूसरे के शीर्ष पर नहीं हो चुकी है. संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए जब तक polarized और प्रयोगों में उपयोग करते हैं, पूरी तरह से तैयार है, के रूप में 2.13 नीचे के माध्यम से 2.10 चरणों में वर्णित Transwells में मध्यम की जगह. मध्यम पूरी तरह से तीन दिनों के बाद जा रहा है Transwells में subcultured प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए, और फिर एक पिछले खिलाने के बाद 4 और फिर तीसरे दिन के बीच बारी चक्र पर, जब तक कोशिकाओं को पूरी तरह से polarized हैं. गर्म EMEM-10 एक पानी के स्नान में 37% डिग्री सेल्सियस धीरे से Transwell आवेषण से मध्यम aspirate. एक केशिका एक सौम्य वैक्यूम के साथ एक वैक्यूम जाल जुड़ी विंदुक के साथ, या एक मानक 1 मिलीलीटर विंदुक, सेल से मुक्त कुओं A1 और D1 से Aspirate मध्यम, तो वरीय कुओं से पहले सभी कुओं से शिखर मध्यम को हटाने, और टी के साथमुर्गी सभी कुओं से basolateral मध्यम हटाने. मत छूना जबकि मध्यम aspirating नहीं डालने झिल्ली. सेल मुक्त कुओं A1 और D1 के शिखर डिब्बे EMEM-10% की 200 μl जोड़ें, तो वरीय कुओं को, शिखर डालने के पक्ष का उपयोग विंदुक टिप गाइड डिब्बे में मध्यम निर्देशन. कोशिकाओं पर सीधे मध्यम जोड़ने के मत करो, और डालने झिल्ली को छूने नहीं है. Basolateral डिब्बों को EMEM-10% की 600 μl जोड़ें. हवा के बुलबुले के basolateral डिब्बों में शुरूआत को रोकने के लिए, प्रत्येक डिब्बे की दीवार के खिलाफ विंदुक angling और धीरे धीरे कुएं में मध्यम को रिहा करके हर एक के लिए मध्यम जोड़ने. 3. एलसीसी Calu-3 के प्रतिरोध विकास का मूल्यांकन सुरक्षा उपाय: बाँझ संस्कृति तकनीक का उपयोग कर एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन. पार उपकला Calu-3 की बिजली (तीर) एलसीसी 30 मिनट के बाद प्रतिरोध का मूल्यांकनमध्यम परिवर्तन, मूल्यांकन प्रत्येक मध्यम परिवर्तन के बाद किया जा सकता है अगर वांछित. बाँझ शर्तों के तहत मापन का प्रदर्शन. नियंत्रण सेल से मुक्त कुओं A1 और D1 (रिक्त स्थान) के माप के साथ शुरू करने के लिए आधारभूत माप प्राप्त करने के लिए, और प्रत्येक के लिए अच्छी तरह माप के साथ जारी है. बाँझ शर्तों के तहत, एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र बाँझ पानी में 70% इथेनॉल युक्त ट्यूब STX2 इलेक्ट्रोड स्थानांतरित करने के लिए, और 15 मिनट बाँझ बनाना. जांचना और उपयोग करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार voltohmmeter परीक्षण. इथेनॉल, हवा शुष्क 5-10 सेकंड से इलेक्ट्रोड निकालें, और बाँझ% EMEM-10 के साथ इलेक्ट्रोड कुल्ला. Voltohmmeter के मोड प्रतिरोध स्थापित करने के लिए स्विच सेट, और सत्ता पर बारी. धीरे से एक 3 बंदरगाहों कि एक Transwell संस्कृति का basolateral डिब्बे में पहुँच की अनुमति में इलेक्ट्रोड जगह है. प्लेस इलेक्ट्रोड ताकि अब नेतृत्व बस हल्के से छू बाहरी अच्छी तरह से नीचे और ऊर्ध्वाधर रहता है,और कम समय का नेतृत्व शिखर डिब्बे के ऊतक संस्कृति के माध्यम में डालने झिल्ली छूने के बिना है. "उपाय आर" बटन पुश, और को स्थिर करने के लिए पढ़ने के लिए प्रतीक्षा करें. प्रत्येक के लिए अच्छी तरह अन्य 2 बंदरगाहों के लिए दोहराएँ और सभी तीन बंदरगाहों से, अच्छी तरह से प्रति तीन मापन के एक कुल के लिए माप रिकॉर्ड. कोशिकाओं के सभी कुओं के लिए प्रतिरोध उपाय करने के लिए आगे बढ़ें. 70% इथेनॉल में 5-10 मिनट भिगोने, बाँझ DH 2 हे में rinsing, और अच्छी तरह सुखाने इलेक्ट्रोड साफ. मूल कंटेनर में स्टोर. प्रत्येक अच्छी तरह से प्रतिरोध की गणना, 1 समीकरण का उपयोग. Ω वास्तविक = Ω नमूना – Ω रिक्त, 1 समीकरण जहां Ω नमूना एक वरीयता प्राप्त अच्छी तरह से और Ω रिक्त से औसत माप 2 कुओं A1 और D1 से औसत माप, जिसमें सम्मिलित करता है और मध्यम, लेकिन कोई कोशिकाओं है. इकाई क्षेत्र प्रतिरोध की गणना, equa का उपयोग2 tion. Ω वास्तविक × प्रभावी झिल्ली क्षेत्र = Ω × 2 सेमी, 2 समीकरण जहां प्रभावी झिल्ली क्षेत्र 0.33 24 अच्छी तरह Transwell आवेषण के लिए 2 सेमी है. सत्यापित करें कि ध्रुवीकरण की एक माध्यमिक परख प्रदर्शन पूरा हो गया है, शिखर और basolateral डिब्बों के बीच निष्क्रिय सोडियम fluorescein प्रसार को मापने पर एक से तीन Transwell संस्कृतियों,. सोडियम fluorescein परख के लिए इस्तेमाल किया कुओं परख के पूरा होने के बाद तुरंत खारिज किया जाना चाहिए. गैर फ्लोरोसेंट बफर तैयार (118 मिमी NaCl, 4.75 मिमी KCl, 2.53 मिमी CACL 0.2 2 एच 2 हे, 2.44 मिमी MgSO 4, 1.19 मिमी KH 2 4 पीओ, 25 मिमी NaHCO बाँझ पानी में 3, 0.45 सुक्ष्ममापी निस्पंदन डिवाइस के साथ बाँझ फिल्टर ). 1 / गैर फ्लोरोसेंट बफर, बाँझ फिल्टर, एल्यूमीनियम पन्नी में लपेट, 4 डिग्री सेल्सियस, प्रकाश से संरक्षित और दुकान में मिलीग्राम मिलीग्राम सोडियम fluorescein तैयार. कमरे temperatu के लिए गर्मउपयोग करने से पहले कर रहे हैं. प्रतिरोध माप को पूरा करने के बाद, ध्यान से एक के लिए तीन अलग – अलग Transwell संस्कृतियों के दोनों basolateral और शिखर डिब्बों से मध्यम हटा दें. Transwell संस्कृतियों कुल्ला. धीरे basolateral डिब्बों और 100 μl कमरे के तापमान D-पीबीएस बाँझ 600 μl कमरे के तापमान बाँझ Dulbecco पीबीएस (डी पीबीएस) शिखर डिब्बों को जोड़ने. धीरे D-पीबीएस कुओं से हटा दें. Basolateral डिब्बों को 600 μl बाँझ गैर फ्लोरोसेंट बफर जोड़ें. शिखर डिब्बों को 100 μl बाँझ सोडियम 1 मिलीग्राम / एमएल fluorescein जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए थाली सेते हैं. सीओ 2 इस ऊष्मायन दौरान आवश्यक नहीं है. ऊष्मायन के दौरान, एक सोडियम fluorescein मानक वक्र 20 ग्राम / मिलीग्राम और 0 ग्राम / मिलीग्राम के बीच लेकर तैयार, गैर फ्लोरोसेंट बफर का उपयोग करने के लिए सोडियम fluorescein पतला. कम से कम 600 μl की एक अंतिम मात्रा में सोडियम fluorescein कम से कम 8 अलग अलग सांद्रता, प्रत्येक तैयार. रखनामानक वक्र dilutions absorbance को मापने के लिए तैयार है जब तक प्रकाश से रक्षा की. विश्लेषण के लिए प्रत्येक परीक्षा Transwell के basolateral डिब्बे से एक अलग साफ ट्यूब गैर फ्लोरोसेंट बफर नमूना हस्तांतरण. परीक्षण Transwells थाली से निष्क्रिय सोडियम fluorescein प्रसार की जांच और त्यागें निकालें. इनक्यूबेटर में शेष Transwells साथ थाली लौटें. एक 96 अच्छी तरह से थाली फ्लैट तली में तीन प्रतियों में प्रत्येक मानक समाधान के 100 μl रखें. गैर फ्लोरोसेंट बफर में प्रत्येक basolateral नमूना के तीन dilutions (1:02, 1:20, 1:50 और) तैयार है, और प्रत्येक undiluted नमूना और प्रत्येक कमजोर पड़ने के 100 μl जोड़ने के लिए, डुप्लिकेट में में, एक 96-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे की थाली. उपाय 486 एनएम या 490 एनएम पर एक एलिसा प्लेट पाठक पर नमूना absorbance. Absorbance के मूल्यों के खिलाफ सोडियम के लिए नमूने के absorbance fluorescein सेंट की तुलना basolateral डिब्बे में सोडियम fluorescein की एकाग्रता का निर्धारणandard वक्र. 4. श्वसन वायरस के साथ Polarized Calu-3 एलसीसी संक्रमण सुरक्षा उपाय: एक जैव सुरक्षा स्तर में बाँझ संस्कृति तकनीक, वायरस का इस्तेमाल किया जा रहा है के लिए उपयुक्त का उपयोग कर एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन. वायरस सीरम मुक्त EMEM में पतला इतना है कि वांछित inocula 100 μl में होगा. कोशिकाओं सीरम मुक्त EMEM में धो लें. धीरे सभी कुओं से मध्यम aspirate, शिखर मध्यम तो basolateral मध्यम को हटाने. एक केशिका एक सौम्य वैक्यूम के साथ एक वैक्यूम जाल जुड़ी विंदुक के साथ, या एक मानक 1 मिलीलीटर विंदुक, सेल से मुक्त कुओं A1 और D1 से Aspirate मध्यम के साथ तो वरीय कुओं से, 1 सभी कुओं से शिखर मध्यम हटाने, और फिर को हटाने सभी कुओं से basolateral मध्यम. मत छूना जबकि मध्यम aspirating नहीं डालने झिल्ली. सेल मुक्त कुओं A1 और D1 के शिखर डिब्बे सीरम मुक्त EMEM के 100 μl जोड़ें, और फिर टीवह वरीयता प्राप्त कुओं, शिखर डिब्बे में डालने के पक्ष का उपयोग विंदुक टिप गाइड मध्यम निर्देशन. कोशिकाओं पर सीधे मध्यम जोड़ने के मत करो, और डालने झिल्ली को छूने नहीं है. 600 μl सीरम मुक्त EMEM के basolateral डिब्बों को जोड़ें. प्रत्येक Transwell डिब्बे की दीवार के खिलाफ विंदुक angling और धीरे धीरे कुएं में मध्यम को रिहा मध्यम जोड़ें. धीरे कुओं से सीरम मुक्त मध्यम aspirate. असंक्रमित या नकली संक्रमित कुओं की शुरुआत के साथ, Transwells के शिखर डिब्बे के लिए उपयुक्त वायरस dilutions जोड़ने. असंक्रमित कुओं के लिए उपयुक्त Transwells के शिखर डिब्बे सीरम मुक्त EMEM के 100 μl जोड़ने के लिए, नकली संक्रमित कुओं के लिए, वायरस मुक्त सीरम मुक्त EMEM में उपयुक्त Transwells के शिखर डिब्बे पतला तैयारी के 100 μl जोड़ें, और के लिए वायरस के संक्रमण, सीरम मुक्त EMEM में वायरस को कमजोर और उपयुक्त Transwells के शिखर डिब्बों के लिए 100 μl जोड़ें. सभी basolateral डिब्बों को सीरम मुक्त EMEM के 600 μl जोड़ें. 37 पर सेते डिग्री सेल्सियस और 2 घंटे के लिए 7% सीओ 2. कुओं से मध्यम Aspirate, असंक्रमित और नकली संक्रमित कुओं से पहले संक्रमित कुओं से तो. शिखर 1 supernatants, basolateral supernatants से निकालें. शिखर डिब्बों और-10% EMEM basolateral डिब्बों में 600 μl में 200 μl% EMEM-10 के साथ मध्यम बदलें.

Representative Results

जब तरल Transwell संस्कृति प्रणालियों में से ढके संस्कृतियों (एलसीसी) के रूप में हो गई है, के रूप में चित्रा 1, Calu तीन फूट डालना कोशिकाओं, विशिष्ट शिखर और basolateral सतहों के विकास में सचित्र. बाद विधि यहाँ वर्णित, पार उपकला एलसीसी Calu-3 की विद्युत प्रतिरोध (तीर) 3 सप्ताह के भीतर या ऊपर 1,000 Ω × 2 सेमी बोने के बाद, जिनमें से एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है पठार तक पहुँचता है. तंग polarized कोशिकाओं के बीच गठित जंक्शनों शिखर और basolateral डिब्बों के बीच छोटे अणुओं की निष्क्रिय संतुलन को रोकने के. इस प्रकार, एक संशोधित सोडियम fluorescein संतुलन परख 15,17,18 एलसीसी Calu-3 के ध्रुवीकरण की पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एलसीसी में बढ़ Calu-3 सेल monolayers के तीर के रूप में, fluorescein की राशि है कि निष्क्रिय basolateral डिब्बे में equilibrates घट जाती है. एक बार Teer 1000 Ω × 2 सेमी, fluorescein की राशि है कि equilibrates≤ 1%, के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है basolateral डिब्बे, इसलिए, Calu-3 एलसीसी कर रहे हैं पूरी तरह से polarized हो जब Teer ≥ 1000 Ω × 2 सेमी है माना जाता है. एलसीसी Calu-3 के शिखर Teer माप प्रयोग से प्रयोग करने के लिए भिन्न हो सकते हैं. हालांकि, किसी भी प्रयोग के लिए एक बार Teer मूल्यों पठार, 5 के लिए एक पूरी तरह से polarized, असंक्रमित Calu तीन एलसीसी स्थिर 12 के बाद बोने सप्ताह के माध्यम से हो सकता है. प्रतिरोध Transwell सुसंस्कृत Calu-3 में विकास के अभाव में कई कारकों के रूप में एक तालिका में उल्लिखित के कारण हो सकता है एक बार में या ऊपर 1,000 Ω × 2 सेमी Calu – तीन एलसीसी पठारों की Teer, मॉडल तैयार करने के लिए जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा है. airway श्वसन रोगज़नक़ों उपकला कोशिका प्रतिक्रियाओं सहित श्वसन syncytial वायरस (RSV),. एक और अधिक तेजी polarized संस्कृति अखंडता में कोशिकाओं के एक नकली संक्रमण (चित्रा 4) की तुलना में गिरावट में RSV परिणाम को एक्सपोजर. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= ""> चित्रा 1. Transwell संवर्धित कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व पार अनुभाग कोशिकाओं डालने झिल्ली के शिखर सतह पर हो रहे हैं. चित्रा 2. पार उपकला विद्युत प्रतिरोध (तीर) और बाद Transwell आवेषण में बोने Calu-3 कोशिकाओं के ध्रुवीकरण की प्रत्येक समय बिंदु पर विकास, Teer मंझला Ω एक्स 2 सेमी के रूप में प्रस्तुत किया है ± SEM एक प्रतिनिधि प्रयोग से 32 स्वतंत्र कुओं की. चित्रा 3. निष्क्रिय equili सोडियम fluorescein सेल Calu-3 monolayers basolateral डिब्बे में bration के रूप में कोशिकाओं polarized हो हिचकते चार स्वतंत्र प्रयोगों से संचयी डेटा प्रस्तुत किया जाता है. प्रत्येक डेटा बिंदु एक व्यक्ति माप का प्रतिनिधित्व करता है. चित्रा 4. Polarized Calu-3 एलसीसी के RSV संक्रमण monolayer अखंडता में गिरावट accelerates Polarized Calu-3 कोशिकाओं. RSV-A2 के साथ एक MOI = 1 0 दिन, संक्रमित और polarity 8 सप्ताह के बाद संक्रमण के लिए नजर रखी थी. एक प्रतिनिधि प्रयोग दिखाया गया है. डेटा संक्रमण के प्रति 8 स्वतंत्र कुओं ± SEM के समय बिंदु प्रति औसत प्रतिरोध के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. * पी <0.05 नकली और RSV-A2 संक्रमित संस्कृतियों के बीच के रूप में छात्र टी परीक्षण द्वारा निर्धारित. तरीके "> मुद्दा संकल्प (ओं) प्रतिरोध औसत दर्जे का नहीं है कुओं में किसी भी हवाई बुलबुले निकालें उपयोग Calu तीन कोशिकाओं है कि जमे हुए स्टॉक से कम से कम 10 बार subcultured Calu तीन कोशिकाओं monolayer subculture में संगम तक पहुंचने के लिए 100% की अनुमति न दें जाँच करें कि कोशिकाओं पर प्लास्टिक डालने के नीचे अच्छी तरह से नहीं बढ़ रहे हैं (यह दर्शाता है कि कोशिकाओं डालने के pores के माध्यम से विकसित हो सकते हैं) पूर्ण प्रतिरोध के विकास के लिए 2-3 सप्ताह की अनुमति के बाद बोने संरचना और आवेषण के ध्यान में लीन होना आकार की जाँच करें, यदि आवश्यक हो तो बदल (सिफारिश की पॉलिएस्टर डालने, 0.3 सुक्ष्ममापी ताकना आकार, कोई कोटिंग्स, जानकारी के लिए सामग्री देखें) इलेक्ट्रोड की गुणवत्ता की जाँच करें, धीरे sanding सिरे से संचित प्रोटीन को हटाने, और यदि आवश्यक हो तो की जगह बैक्टीरिया विकास के लिए माध्यम की जाँच करें </ul> प्रतिरोध विकसित, लेकिन पूरा ध्रुवीकरण (≥ 1000 Ω × 2 सेमी) प्राप्त नहीं है अतिरिक्त समय की अनुमति के लिए करने के लिए विकसित ध्रुवीकरण (कभी कभी 4 सप्ताह तक लग सकते हैं) उपयोग Calu तीन कोशिकाओं है कि जमे हुए स्टॉक से कम से कम 10 बार subcultured Calu तीन कोशिकाओं monolayer subculture में संगम तक पहुंचने के लिए 100% की अनुमति न दें लगातार Transwell संस्कृतियों में मध्यम बदलने के लिए, पिछले खिलाने के बाद तीसरे और फिर चौथे दिन के बीच बारी आवेषण कि प्लेटों के बाहरी पंक्तियों में रखा जाता है पर केवल संस्कृति कोशिकाओं Transwell आवेषण के एक बहुत अलग का उपयोग करें कोशिकाओं को पूरी तरह फूट डालना है, लेकिन प्रतिरोध एक पढ़ने से अगले करने के लिए संगत नहीं है को बाधित इनक्यूबेटर में प्लेटें ढेर या नहीं जैव सुरक्षा कैबिनेट में कंपन कारण मत जबकि Transwell बेनीतों को नियंत्रित किया जा रहा है कुओं में किसी भी हवाई बुलबुले निकालें विंदुक युक्तियाँ जब मीडिया को बदलने या Teer रीडिंग प्रदर्शन के साथ सेल परत परेशान मत करो शिखर डिब्बे में 200 μl माध्यम का उपयोग करें, कम मात्रा अस्थिर Teer रीडिंग में परिणाम हो सकता है इलेक्ट्रोड की गुणवत्ता की जाँच करें, धीरे sanding टिप से संचित प्रोटीन को हटाने के लिए, और की जगह यदि आवश्यक हो तो टेबल एक मुसीबत शूटिंग समस्याओं है कि संवर्धन Calu तीन जब Transwells में कोशिकाओं उत्पन्न हो सकती है. कई कारकों तरल से ढके संस्कृतियों, जिनमें से सबसे अधिक संभावना इस तालिका में डाला जाता है Calu तीन कोशिकाओं के पूर्ण ध्रुवीकरण के लिए योगदान करते हैं.

Discussion

जब Transwell आवेषण में एलसीसी Calu-3 की स्थापना, कोशिकाओं में नहीं फूट डालना, या फूट डालना पूरी तरह से नहीं हो सकता है हो सकता है, के रूप में एक Teer द्वारा परिभाषित ≥ 1000 Ω × ² सेमी और ≤ 1% सोडियम fluorescein डाई शिखर और basolateral डिब्बों के बीच संतुलन. इसके अलावा, एलसीसी में Calu तीन कोशिकाओं को पूरी तरह से फूट डालना, लेकिन हो सकता है Teer मापन के बीच असंगत हो सकता है. हालांकि तीन एलसीसी Calu Teer माप में उतार चढ़ाव के दिन से दिन में सामान्य हो रहे हैं, जब तक एक बार पूरी तरह से polarized Teer में नाटकीय झूलों संस्कृति स्वाभाविक रूप से उम्र के साथ गिरावट आती है, जो सप्ताह के रूप में छोटे रूप में 5 या के रूप में लंबे समय के रूप के रूप में 12 सप्ताह का हो सकता है नहीं की उम्मीद कर रहे हैं बोने के बाद.

एलसीसी Calu-3 की क्षमता के लिए फूट डालना कैसे कोशिकाओं को बनाए रखा है और Transwell प्रणाली में उपयोग करने से पहले subcultured पर भाग में निर्भर करता है. कोशिकाओं है कि एक monolayer के रूप में 90% संगम परे subculturing दौरान हो गए हैं, कि स्टॉक से जमे हुए किया गया है 10 से अधिक बार subcultured, या कि नहीं होना हैएन एक नियमित समय पर ताजा माध्यम से आपूर्ति की है और कम करने के लिए पूरी तरह से फूट डालना की संभावना है, और किसी भी ध्रुवीकरण तेजी से गिरावट की संभावना है. ध्रुवीकरण का अधूरा या कुल कमी भी सामग्री और Calu तीन एलसीसी के लिए इस्तेमाल किया Transwells के ध्यान में लीन होना आकार में बदलाव के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, और बहुत कुछ करने के लिए बहुत कुछ इसी तरह की संरचना और ताकना आकार की Transwells में भिन्नता भी ध्रुवीकरण को प्रभावित कर सकता है. बड़ा आकार ताकना Calu-3 Transwell झिल्ली माध्यम से basolateral डिब्बे में विकसित करने के लिए, ध्रुवीकरण से संस्कृति को रोकने की अनुमति दे सकते हैं. ध्रुवीकरण का अभाव भी बैक्टीरियल वृद्धि की वजह से हो सकता है, जो Calu तीन कोशिकाओं के बीच तंग जंक्शनों के बाद टूटने की ओर जाता है मेघमय संस्कृति के माध्यम से संकेत दिया.

एलसीसी Calu-3 के चर Teer माप एलसीसी Calu – तीन सेल monolayers, आवेषण, या खुद प्लेटों के यांत्रिक अवरोधों की वजह से हो सकता है. मध्यम परिवर्तन और Teer माप विंदुक युक्तियाँ या विद्युत के बिना प्रदर्शन किया जाना चाहिएडे कोशिकाओं को छू जाता है. जबकि इन आपरेशनों प्रदर्शन, देखभाल शिखर और basolateral डिब्बों, जो voltohmmeter प्रतिरोध का पता लगाने की क्षमता को बाधित करेगा में हवाई बुलबुले शुरू से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. इलेक्ट्रोड होता है पर प्रोटीन buildup द्वारा voltohmmeter एक संस्कृति है कि वास्तव में है polarized में प्रतिरोध का पता लगाने की क्षमता भी सीमित हो सकता है. निर्माण ऊपर कोमल sanding के साथ हटाया जा सकता है, या इलेक्ट्रोड की जगह से सुधारा जा सकता है.

एक बार Calu-3 एलसीसी पूरी तरह से फूट डालना और Teer नहीं रह बढ़ रही है, Calu-3 एलसीसी श्वसन संक्रमण के मेजबान फेफड़ों उपकला कोशिका प्रतिक्रियाओं निस्र्पक के लिए इन विट्रो मॉडल में एक के रूप में उपयोग के लिए तैयार हैं. इस प्रणाली monolayer सुसंस्कृत सेल फेफड़ों परंपरागत रूप से A549 और Hep दो कोशिकाओं के रूप में सांस रोगजनकों, का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया लाइनों की तुलना में रोगज़नक़ों Calu-3 एलसीसी bei का अतिरिक्त लाभ के साथ दिशात्मक प्रतिक्रियाओं के बेहतर लक्षण, परमिटएनजी अधिक विकसित करने, तेजी से और अधिक आसानी से प्राप्त की है, और कम प्राथमिक, polarized, विभेदित NHBE से उत्पन्न करने के लिए महंगा है. NHBE करने के लिए इसी प्रकार, polarized Calu-3 तंग जंक्शन गठन का प्रदर्शन, और mucins उत्पादन. हालांकि, NHBE विपरीत, polarized Calu 3 कोशिकाओं बेसल कोशिकाओं और रोमक खानेदार उपकला कोशिकाओं की परतों में अंतर नहीं है, और कुछ polarized Calu-3 कोशिकाओं cilia अनुमानों की तरह ¹⁹ विकसित करना. इस प्रकार, हालांकि airway उपकला कोशिकाओं के श्वसन अपमान polarized प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए उपयोगी है, polarized Calu-3 एलसीसी श्वसन अपमान या चोट के जवाब में airway विकास या remodeling की जांच के लिए एक आदर्श मॉडल नहीं हैं. इन विट्रो में संवर्धित कोशिकाओं द्वारा बलगम उत्पादन संक्रामकता सेलुलर, साथ ही संक्रामक और एक polarized मॉडल में वायरस फैल वायरस की रिहाई, और polarized Calu तीन एलसीसी और polarized, विभेदित NHBE सूचित नहीं किया गया है के बीच बलगम उत्पादन के एक प्रत्यक्ष तुलना प्रभाव हो सकता है . A549 और Hep दो कोशिकाओंसंस्कृति को Calu तीन कोशिकाओं की तुलना में आसान कर रहे हैं, हालांकि, एलसीसी Calu-3 के विपरीत, वे polarized संस्कृतियों फार्म नहीं जब Transwell आवेषण पर हो, और इन विट्रो में जांच polarized उपकला कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं के लिए श्वसन वायरस के संक्रमण के लिए आदर्श नहीं इस प्रकार मॉडल हैं .

Materials

			REAGENTS
Calu-3	ATCC	HTB-55
0.05% Trypsin – 0.02% EDTA	Gibco/Invitrogen	25300
Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM)	Gibco/Invitrogen	07-00100DK
Fetal bovine serum (FBS)	HyClone	SH30070.03	Heat-inactivate, 56 °C, 30 mins
Non-essential amino acids 100X (10 mM)	Gibco/Invitrogen	11140	Store at 4 °C in the dark
L-glutamine	Gibco/Invitrogen	25030
HEPES	Gibco/Invitrogen	15630
EMEM-10% FBS (EMEM-10%)			Supplement EMEM with heat-inactivated FBS to 10% serum, sterile-filter
EMEM-20% FBS + supplements (EMEM-20%+S)			Supplement EMEM to final concentrations: heat-inactivated FBS, 20%; 1X amino acids; 2 mM L-glutamine; 10 mM HEPES; sterile-filter
24-well Transwell plates	Corning Costar	3472	3 μm pore size, polyester
Trypan blue	Gibco/Invitrogen	15250
Ethanol	Sigma	E7023	Prepare to 70% using sterile dH2O
Dulbecco’s PBS (D-PBS)	Invitrogen	14040
Non-fluorescent buffer			118 mM NaCl; 4.75 mM KCl; 2.53 mM CaCl2×H2O; 2.44 mM MgSO4; 1.19 mM KH2PO4; 25 mM NaHCO3 in sterile water; sterile-filter
Sodium fluorescein	Sigma	6377	1 mg/ml in sterile non-fluorescent buffer; sterile-filter, protect from light; store at 4 °C up to 6 months
			EQUIPMENT
Voltohmmeter	World Precision Instruments
STX2 electrode	World Precision Instruments
ELISA plate reader			Capable of measuring A486 or A490