Funnene og konklusjonene i denne rapporten er de av forfatterne, og ikke nødvendigvis representerer synspunktene til Centers for Disease Control and Prevention.
De apikale og basolateral overflater luftveier epitelceller demonstrere retningsbestemt respons på patogen eksponering in vivo. Dermed ideell in vitro modeller for å undersøke cellulære responser til luftveispatogener polarisere, forming apikale og basolateral overflater. En slik modell er differensiert normale humane bronchial epitelceller (NHBE). Imidlertid krever dette systemet lunge vevsprøver, kompetanse isolere og dyrke epitelceller fra vev, og tid til å generere en luft-væske-grensesnittet kultur.
Calu-3 celler, avledet fra et menneske bronkial adenokarsinom, er en alternativ modell for å undersøke responsen proksimale luftveier epitelceller luftveiene fornærmelse 1, farmakologiske forbindelser 2-6, og bakteriell 7-9 og virale patogener, inkludert influensa virus, rhinovirus og alvorlig akutt respiratorisk syndrom – tilknyttet coronavirus 10-14. Nylig, we viste at Calu-3 celler er utsatt for respiratorisk syncytial virus (RSV) hos en måte som er forenlig med NHBE 15,16. Her vi detalj etablering av et polarisert, væske-dekket kultur (LCC) i Calu-3 celler, med fokus på de tekniske detaljene for å vokse og dyrking Calu-3 celler, opprettholde celler som har blitt dyrket i LCC, og vi presenterer Metoden for å utføre respiratorisk virus infeksjon av polariserte Calu-3-celler.
Å konsekvent få polarisert Calu-3 LCC, Calu-3 celler må nøye subkultiveres før dyrking i Transwell innsatser. Calu-3 monolagskulturer bør ligge under 90% konfluens, bør subkultiveres færre enn 10 ganger fra frossen lager, og bør med jevne leveres med friskt medium. Når dyrket i Transwells, må Calu-3 LCC håndteres med forsiktighet. Uregelmessig medier endringer og mekanisk eller fysisk forstyrrelse av cellelagene eller plater negativ innvirkning polarisering forflere timer eller dager. Polarisering er overvåket ved å evaluere trans-epitelial elektrisk motstand (Teer) og er bekreftet ved å evaluere den passive likevekt av natrium fluorescein mellom apikale og basolateral avdelinger 17,18. Når Teer platåer på eller over 1000 Ω × cm 2, Calu-3 LCC er klar til å bruke til å undersøke cellulære responser til respiratoriske patogener.
Ved etablering Calu-3 LCC i Transwell innsatser, kan cellene ikke polarisere det hele tatt, eller kanskje ikke fullt polarisere, som definert av en Teer ≥ 1000 Ω × cm 2 og ≤ 1% natrium fluorescein fargestoff likevekt mellom apikale og basolateral avdelinger. I tillegg kan Calu-3-celler i LCC fullt polarisere, men teer kan være inkonsekvent mellom målinger. Selv svingninger i Teer målinger av Calu-3 LCC er normalt fra dag til dag, er nok en helt polarisert, dramatiske svingninger i Teer ikke forventet før kulturen naturlig avtar med alderen, noe som kan være så lite som 5 uker eller så lenge som 12 uker etter såing.
Evnen Calu-3 LCC å polarisere avhenger delvis av hvor celler vedlikeholdt og subkultivert før bruk i Transwell systemet. Celler som har vokst utover 90% konfluens som et enkeltlag under subculturing, som har blitt subkultivert mer enn 10 ganger fra frossen lager, eller som ikke har væreno forsynes med fersk medium regelmessig er mindre sannsynlig å fullt polarisere, og enhver polarisering er sannsynlig å avta raskt. Ufullstendig eller total mangel på polarisering kan også tilskrives variasjon i materialet og porestørrelsen av Transwells brukes for Calu-3 LCC, og varen til lot variasjon i Transwells med lignende sammensetning og porestørrelse kan også påvirke polarisering. Større porestørrelser kan tillate Calu-3 for å vokse gjennom Transwell membranen inn i basolateral kupé, hindrer kultur fra polariserende. Et fravær av polarisering kan også skyldes bakterievekst, angitt med tåkete kultur medium, noe som fører til påfølgende nedbryting av tett veikryss mellom Calu-3 celler.
Variable teer målinger av Calu-3 LCC kan være forårsaket av mekaniske forstyrrelser av Calu-3 LCC celle monolag, skivene eller platene selv. Medium endringer og Teer målinger bør utføres uten pipettespissene eller elektrode fører berøre cellene. Mens du utfører disse operasjonene, bør man sørge for å unngå å introdusere luftbobler inn i apikale og basolateral rom, hvilket vil forstyrre evnen til voltohmmeter å oppdage motstand. Muligheten av voltohmmeter å oppdage resistens i en kultur som er faktisk polarisert kan også begrenses av proteinbelegg på elektrodeavledningene. Dette oppbyggingen kan fjernes med milde sliping, eller kan bli korrigert ved å erstatte elektroden.
Gang Calu-3 LCC helt polarisere og Teer ikke lenger stiger, Calu-3 LCC er klare for bruk som en de vitro modell for å karakterisere vert lunge epithelial celle responser til luftveisinfeksjon. Dette systemet tillater bedre karakterisering av retningsbestemt respons på patogener i forhold til monolayer-dyrkede lunge cellelinjer som tradisjonelt er brukt til å studere respiratoriske patogener, som for eksempel A549 og HEP-2 celler, med de ekstra fordelene ved Calu-3 LCC being raskere å utvikle, lettere oppnås, og mindre kostbart å skape enn primær, polarisert, differensiert NHBE. I likhet med NHBE, polarisert Calu-3 demonstrere tett veikryss formasjon, og produserer mucins. Men i motsetning til NHBE, gjør polarisert Calu-3 celler ikke differensiere i lag med basal celler og ciliated columnar epitelceller, og få polariserte Calu-3 celler utvikle cilia-lignende anslag 19. Derfor, selv om nyttige for behandlingen polariserte reaksjoner i luftveiene epitelceller til luftveiene fornærmelse, polarisert Calu-3 LCC er ikke en ideell modell for å undersøke luftveiene utvikling eller ombygging i respons til luftveiene fornærmelse eller skade. Slimproduksjon av dyrkede celler de vitro kan påvirke cellulær smittsomhet, samt frigjøring av infeksiøst virus og virus oppslag i en polarisert modell, og en direkte sammenligning av slimproduksjon mellom polarisert Calu-3 LCC og polarisert, differensiert NHBE har ikke blitt rapportert . A549 og HEP-2 celler enre lettere å kultur enn Calu-3 celler, men i motsetning Calu-3 LCC, har de ikke danner polariserte kulturer når dyrket på Transwell innstikk, og er således ikke ideelle modeller for å undersøke in vitro svarene polariserte epitelceller i luftveiene virusinfeksjon .
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Elisabeth Blanchard for henne teknisk assistanse. Funnene og konklusjonene i denne rapporten er de av forfatterne, og ikke nødvendigvis representerer synspunktene til Centers for Disease Control and Prevention.
REAGENTS | |||
Calu-3 | ATCC | HTB-55 | |
0.05% Trypsin – 0.02% EDTA | Gibco/Invitrogen | 25300 | |
Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Gibco/Invitrogen | 07-00100DK | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30070.03 | Heat-inactivate, 56 °C, 30 mins |
Non-essential amino acids 100X (10 mM) | Gibco/Invitrogen | 11140 | Store at 4 °C in the dark |
L-glutamine | Gibco/Invitrogen | 25030 | |
HEPES | Gibco/Invitrogen | 15630 | |
EMEM-10% FBS (EMEM-10%) | Supplement EMEM with heat-inactivated FBS to 10% serum, sterile-filter | ||
EMEM-20% FBS + supplements (EMEM-20%+S) | Supplement EMEM to final concentrations: heat-inactivated FBS, 20%; 1X amino acids; 2 mM L-glutamine; 10 mM HEPES; sterile-filter | ||
24-well Transwell plates | Corning Costar | 3472 | 3 μm pore size, polyester |
Trypan blue | Gibco/Invitrogen | 15250 | |
Ethanol | Sigma | E7023 | Prepare to 70% using sterile dH2O |
Dulbecco’s PBS (D-PBS) | Invitrogen | 14040 | |
Non-fluorescent buffer | 118 mM NaCl; 4.75 mM KCl; 2.53 mM CaCl2×H2O; 2.44 mM MgSO4; 1.19 mM KH2PO4; 25 mM NaHCO3 in sterile water; sterile-filter | ||
Sodium fluorescein | Sigma | 6377 | 1 mg/ml in sterile non-fluorescent buffer; sterile-filter, protect from light; store at 4 °C up to 6 months |
EQUIPMENT | |||
Voltohmmeter | World Precision Instruments | ||
STX2 electrode | World Precision Instruments | ||
ELISA plate reader | Capable of measuring A486 or A490 |