Resultaten och slutsatserna i denna rapport är författarnas egna och representerar inte nödvändigtvis åsikterna hos Centers for Disease Control and Prevention.
Den apikala och basolaterala ytor epitelceller i luftvägarna visar riktade svar på patogen exponering in vivo. Således perfekt in vitro-modeller för att undersöka cellulära svar på respiratoriska patogener polarisera och bildar apikala och basolaterala ytor. En sådan modell är differentierad normala humana bronkialepitelceller (NHBE). Emellertid kräver detta system lung vävnadsprover, expertis isolering och odling epitelceller från vävnad, och tid för att generera ett luft-vätske-gränssnittet kultur.
Calu-3-celler, härledda från en human bronkial adenokarcinom, är en alternativ modell för att undersöka gensvaret hos proximala epitelceller i luftvägarna till respiratorisk förolämpning 1, farmakologiska föreningar 2-6, och bakteriella 7-9 och virala patogener, inklusive influensavirus, rhinovirus och svår akut respiratorisk sjukdom – associerad coronavirus 10-14. Nyligen, we visade att Calu-3-celler är känsliga för respiratoriskt syncytialvirus (RSV) infektion på ett sätt som överensstämmer med NHBE 15,16. Här har vi detalj inrättandet av en polariserad, flytande täckta kultur (LCC) i Calu-3-celler, med fokus på de tekniska detaljerna i växande och odling Calu-3-celler, underhåll celler som har odlats i LCC, och vi presenterar metod för att utföra respiratorisk virusinfektion av polariserade Calu-3-celler.
Att konsekvent erhålla polariserad Calu-3 LCC, Calu-3 celler måste noggrant subodlas före odling i Transwell skär. Calu-3 monoskiktkulturer bör förbli under 90% sammanflöde, bör subkultiveras färre än 10 gånger från frysta lager, och bör regelbundet förses med färskt medium. När odlas i Transwells måste Calu-3 LCC hanteras varsamt. Oregelbundna media förändringar och mekanisk eller fysisk störning av cellskikten eller plattor inverka negativt polarisering förflera timmar eller dagar. Polarisering övervakas genom att utvärdera trans-epitelial elektriskt motstånd (TEER) och verifieras genom att utvärdera den passiva utjämning av natriumfluorescein mellan de apikala och basolaterala fack 17,18. När TEER platåer vid eller över 1.000 Ω × cm 2, Calu-3 LCC är redo att använda för att undersöka cellulära svar på respiratoriska patogener.
Vid fastställandet Calu-3 LCC i Transwell skär, kan celler polarisera inte alls, eller kanske inte helt polarisera, som definieras av en TEER ≥ 1000 Ω × cm 2 och ≤ 1% natriumfluorescein färgämne jämvikt mellan de apikala och basolaterala fack. Dessutom kan Calu-3-celler i LCC polarisera fullständigt, men TEER kan vara inkonsekvent mellan mätningarna. Även variationer i Teer mätningar av Calu-3 LCC är normala från dag till dag, är en gång helt polariserade, dramatiska svängningar i TEER förväntas inte förrän kulturen naturligt avtar med åldern, vilket kan vara så lite som fem veckor eller så länge som 12 veckor efter ympning.
Förmågan hos Calu-3 LCC att polarisera beror delvis på hur cellerna upprätthålls och subodlades före användning i Transwell-systemet. Celler som har vuxit mer än 90% sammanflöde som monolager under subodling, som har subodlas mer än 10 gånger från frysta lager, eller som inte har attsv levereras med färskt medium på ett regelbundet schema är mindre benägna att helt polarisera, och varje polarisering kommer sannolikt att sjunka snabbt. Ofullständig eller total avsaknad av polarisering kan också tillskrivas variationer i materialet och porstorlek Transwells används för Calu-3 LCC, och mycket till parti variation i Transwells av liknande sammansättning och porstorlek kan också påverka polarisering. Större porstorlekar kan tillåta Calu-3 för att växa genom Transwell membranet till basolaterala facket, hindrar kulturen från polariserande. En avsaknad av polarisation också kan bero på bakteriell tillväxt, indikeras av grumlade odlingsmedium, vilket leder till efterföljande nedbrytning av de täta förbindelserna mellan Calu-3-celler.
Variabla TEER mätningar av Calu-3 LCC kan orsakas av mekaniska störningar av Calu-3 LCC cellmonoskikt, insatserna, eller plattorna själva. Medium förändringar och mätningar Teer bör utföras utan pipettspetsar eller elektrode leder vidröra cellerna. När de utför dessa operationer, bör man för att undvika att införa luftbubblor i de apikala och basolaterala fack, vilket kommer att störa förmåga voltohmmeter att upptäcka motstånd. Förmågan hos voltohmmeter att detektera resistens i en kultur som är faktiskt polariserad kan också begränsas av proteinbeläggningar på elektroden leder. Detta uppbyggnad kan avlägsnas med mild slipning eller kan korrigeras genom att ersätta elektroden.
När Calu-3 LCC fullständigt polariserar och TEER inte längre ökar, Calu-3 LCC är färdiga för användning som en in vitro-modell för att karakterisera värd lung epithelial cellsvar till luftvägsinfektion. Detta system tillåter bättre karakterisering av riktade svar på patogener jämfört med monoskikt-odlade linjer lung cellinjer traditionellt används för att studera respiratoriska patogener, såsom A549 och HEp-2-celler, med de ytterligare fördelarna med Calu-3 LCC being snabbare att utveckla, mera lätt erhållas, och billigare att generera än primär, polariserad, differentierad NHBE. I likhet med NHBE, polariserade Calu-3 visar tät korsningen bildning, och producera muciner. Men till skillnad från NHBE, inte skilja polariserade Calu-3-celler inte in lager av basala celler och cilierade kolumnära epitelceller, och få polariserade Calu-3 celler utvecklas flimmerhår-liknande projektioner 19. Även om användbara för att undersöka polariserade svar epitelceller i luftvägarna till respiratorisk förolämpning, polariserade Calu-3 LCC är inte en idealisk modell för att undersöka luftvägarna utveckling eller ombyggnad som svar på andningsorganen förolämpning eller skada. Slem produktion av odlade celler in vitro kan påverka cellulär smittsamhet, samt utsläpp av infektiöst virus och virus sprids i en polariserad modell och en direkt jämförelse av slem produktionen mellan polariserat Calu-3 LCC och polariserad, differentierad NHBE har inte rapporterats . A549 och HEp-2-celler enre lättare att kultur än Calu-3-celler, men till skillnad från Calu-3 LCC, bildar de inte polariserade kulturer när de odlas på Transwell skär, och är således inte idealmodeller för att undersöka in vitro svaren på polariserade epitelceller till respiratorisk virusinfektion .
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Elisabeth Blanchard för hennes hjälp. Resultaten och slutsatserna i denna rapport är författarnas egna och representerar inte nödvändigtvis åsikterna hos Centers for Disease Control and Prevention.
REAGENTS | |||
Calu-3 | ATCC | HTB-55 | |
0.05% Trypsin – 0.02% EDTA | Gibco/Invitrogen | 25300 | |
Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Gibco/Invitrogen | 07-00100DK | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30070.03 | Heat-inactivate, 56 °C, 30 mins |
Non-essential amino acids 100X (10 mM) | Gibco/Invitrogen | 11140 | Store at 4 °C in the dark |
L-glutamine | Gibco/Invitrogen | 25030 | |
HEPES | Gibco/Invitrogen | 15630 | |
EMEM-10% FBS (EMEM-10%) | Supplement EMEM with heat-inactivated FBS to 10% serum, sterile-filter | ||
EMEM-20% FBS + supplements (EMEM-20%+S) | Supplement EMEM to final concentrations: heat-inactivated FBS, 20%; 1X amino acids; 2 mM L-glutamine; 10 mM HEPES; sterile-filter | ||
24-well Transwell plates | Corning Costar | 3472 | 3 μm pore size, polyester |
Trypan blue | Gibco/Invitrogen | 15250 | |
Ethanol | Sigma | E7023 | Prepare to 70% using sterile dH2O |
Dulbecco’s PBS (D-PBS) | Invitrogen | 14040 | |
Non-fluorescent buffer | 118 mM NaCl; 4.75 mM KCl; 2.53 mM CaCl2×H2O; 2.44 mM MgSO4; 1.19 mM KH2PO4; 25 mM NaHCO3 in sterile water; sterile-filter | ||
Sodium fluorescein | Sigma | 6377 | 1 mg/ml in sterile non-fluorescent buffer; sterile-filter, protect from light; store at 4 °C up to 6 months |
EQUIPMENT | |||
Voltohmmeter | World Precision Instruments | ||
STX2 electrode | World Precision Instruments | ||
ELISA plate reader | Capable of measuring A486 or A490 |