El Protein Complex Plataforma de Producción MultiBac en el EMBL
Summary
Complejos de proteínas catalizan las funciones celulares clave. Caracterización detallada funcional y estructural de muchos complejos esenciales requiere la producción recombinante. MultiBac es un sistema de células de baculovirus / insecto particularmente adaptado para la expresión de proteínas eucarióticas y sus complejos. MultiBac se implementó como una plataforma de acceso libre, y los procedimientos operativos estándar desarrollados para maximizar su utilidad.
Abstract
La investigación proteómica revela la impresionante complejidad de proteomas eucariotas en un detalle sin precedentes. Ahora es un principio comúnmente aceptado que las proteínas en las células de la mayoría no existen como entidades aisladas sino que ejercen su actividad biológica en asociación con muchas otras proteínas, en los seres humanos diez o más, la formación de líneas de montaje en la célula para la mayoría si no todas las funciones vitales. 1 , 2 El conocimiento de la función y la arquitectura de estos conjuntos multiproteicos requiere su disposición en calidad superior y en cantidad suficiente para un análisis detallado. La escasez de muchos complejos de proteínas en las células, en particular, en los eucariotas, prohíbe su extracción a partir de fuentes nativas, y requiere la producción recombinante. El sistema vector de expresión de baculovirus (BEVS) ha demostrado ser particularmente útil para la producción de proteínas eucarióticas, la actividad de los cuales a menudo se basa en el procesamiento post-traduccional que otros sistemas de expresión comúnmente utilizados a menudo puedeno son compatibles. 3 BEVS utilizar un baculovirus recombinante en el que se insertó el gen de interés para infectar cultivos de células de insectos que a su vez producen la proteína de elección. MultiBac es un BEVS que ha sido especialmente adaptado para la producción de complejos de proteínas eucariotas que contienen muchas subunidades. 4 Un requisito previo importante para la producción eficiente de proteínas y sus complejos son robustos protocolos para todos los pasos implicados en un experimento de expresión que, idealmente, puede ser implementado como los procedimientos normalizados de trabajo (PNT) y seguido también por usuarios no especializados con relativa facilidad. La plataforma MultiBac en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL) utiliza procedimientos normalizados de trabajo para todos los pasos implicados en un complejo multiproteico experimento de expresión, a partir de la inserción de los genes en un genoma de baculovirus ingeniería optimizado para la producción de proteínas heterólogas propiedades para el análisis a pequeña escala de la proteína ejemplares producidos. 5-8 La plataforma dese instala en un modo de acceso abierto en el EMBL de Grenoble y ha apoyado a muchos científicos de la academia y la industria para acelerar los proyectos de investigación complejos proteicos.
Introduction
La actividad biológica se controla por conjuntos de proteínas y otras biomoléculas que actúan en concierto para catalizar las funciones celulares. Los ejemplos notables incluyen la maquinaria que transcribe la información genética contenida en el ADN en ARN mensajero. En los seres humanos, más de 100 proteínas se unen en un proceso definido y regulado para transcribir los genes, la formación de grandes complejos multiproteicos de 10 y más subunidades incluyendo el ARN polimerasa II y los factores de transcripción generales, tales como TFIID, TFIIH y otros. 9 Otros ejemplos son los ribosoma, que consta de muchas proteínas y moléculas de ARN, que cataliza la síntesis de proteínas, o el complejo del poro nuclear, que es responsable de shuttling biomoléculas a través de la envoltura nuclear en eucariotas. Una disección de arquitectura y bioquímica detallada de esencialmente todas las máquinas multicomponente en la célula es vital para entender su función. La elucidación de la estructura de procariótico y eukarribosomas yotic, por ejemplo, constituyeron acontecimientos característicos que producen una visión sin precedentes de cómo estas máquinas macromoleculares llevar a cabo sus funciones designadas en la célula. 10,11
Los ribosomas se pueden obtener en cantidad y calidad suficiente para un estudio detallado mediante la purificación del material endógeno de las células cultivadas, debido al hecho de que hasta el 30% de la masa celular consta de los ribosomas. ARN polimerasa II ya es menos abundante en órdenes de magnitud, y muchos miles de litros de cultivo de levadura tenía que ser procesada para obtener una vista atómica detallada de este complejo central y esencial para la transcripción. 12 La inmensa mayoría de los otros complejos son sin embargo esenciales presentes en cantidades mucho más bajas en células nativas, y por lo tanto no pueden purificarse adecuadamente a partir de material fuente nativa. Para hacer tales complejos accesibles para el análisis estructural y funcional detallado requiere la producción heteróloga utilizando te recombinantechniques.
Producción de proteína recombinante tenía un gran impacto en la investigación biológica. Muchas proteínas fueron producidos de forma recombinante, y su estructura y función disecados en alta resolución. Programas de genómica estructural han aprovechado el esclarecimiento de los genomas de muchos organismos para abordar el repertorio de productos de genes de organismos enteros en el modo de alto rendimiento (HT). Miles de estructuras de proteínas por lo tanto se han determinado. Hasta la fecha, el sistema más utilizado prolíficamente para la producción de proteínas recombinantes ha sido E. coli, y muchos sistemas de expresión se han desarrollado y perfeccionado en los años para la producción heteróloga en este huésped. Los plásmidos que albergan una gran cantidad de funcionalidades para permitir la producción de proteínas en E. coli llenan catálogos enteros de proveedores comerciales.
Sin embargo, E. coli tiene ciertas limitaciones que lo hacen inadecuado para producir muchas proteínas eucarióticas y en particulares complejos de proteínas con muchas subunidades. Por lo tanto, la producción de proteínas en huéspedes eucariotas se ha convertido en cada vez más el método de elección en los últimos años. Un sistema particularmente bien adaptado para producir proteínas eucariotas es el sistema vector de expresión de baculovirus (BEVS) que se basa en un baculovirus recombinante que lleva los genes heterólogos para infectar cultivos de células de insectos cultivadas en el laboratorio. El sistema de MultiBac es un BEVS más recientemente desarrollados, que se adaptan particularmente para la producción de complejos de proteínas eucarióticas con muchas subunidades (Figura 1). MultiBac se introdujo por primera vez en 2004. 13 Desde su introducción, MultiBac se ha perfeccionado continuamente y se racionaliza para simplificar el manejo, mejorar la calidad de la proteína diana y generalmente haciendo que el sistema sea accesible a los usuarios que no son especialistas en el diseño de los procedimientos normalizados de trabajo (PNT eficientes). 4 MultiBac se ha implementado en muchos laboratorios de todo el mundo, en la acAdemia y la industria. En el EMBL de Grenoble, los programas de acceso transnacionales se pusieron en marcha por la Comisión Europea para proporcionar la formación de expertos en la plataforma MultiBac para los científicos que desean utilizar este sistema de producción para el avance de sus investigaciones. La estructura y la función de muchos complejos de proteínas que eran hasta ahora no accesible se dilucidan mediante muestras producidas con MultiBac. 4 En la siguiente, los pasos esenciales de la producción MultiBac se resumen en protocolos como están en operación en la instalación MultiBac en el EMBL Grenoble.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vídeo instantáneas en las Figuras 2 y 3 ilustran todo el proceso de generación asistida por robot a partir de ADNc de expresión multigénica construye todo el camino a la infección de cultivos de células de insectos para la producción de proteínas. Nuevos reactivos (plásmidos y virus) y protocolos robustos se han desarrollado para permitir una tubería de depender de SOP. Toda la tubería se ha implementado como una plataforma tecnológica en el EMBL de Grenoble. La plataforma …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond y todos los miembros anteriores y actuales del laboratorio Berger en busca de ayuda y consejo. La plataforma MultiBac y su desarrollo han sido y están generosamente apoyada por las agencias de financiamiento como la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (FNS), la Agencia Nacional de Investigación (ANR) y el Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) y la Comisión Europea (CE) en los Programas Marco (PM) 6 y 7. Apoyo al acceso transnacional es proporcionada por los proyectos de la CE 7PM P-CUBE ( www.p-cube.eu ) y BioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). El Ministerio de Ciencia francés es reconocido sobre todo para apoyar la plataforma MultiBac en el EMBL a través de la Inversión de Avenir proyecto Frisbi.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
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