على البروتين MultiBac مجمع منصة الإنتاج في EMBL
Summary
مجمعات البروتين تحفيز الوظائف الخلوية الرئيسية. مفصلة توصيف وظيفي وهيكلي للعديد من المجمعات الأساسية يتطلب إنتاج المؤتلف. MultiBac هو نظام خلية الفيروسة العصوية / الحشرات مصممة بشكل خاص للتعبير عن البروتينات حقيقية النواة والمجمعات الخاصة بهم. تم تنفيذ MultiBac بمثابة منصة مفتوحة الوصول، وإجراءات التشغيل القياسية وضعت لتعظيم فائدتها.
Abstract
أظهرت أبحاث البروتينات تعقيد رائعة من proteomes حقيقية النواة بالتفصيل لم يسبق لها مثيل. وهو الآن فكرة مقبولة عموما أن البروتينات في خلايا موجودة في الغالب لا ككيانات منعزلة، بل ممارسة النشاط البيولوجي في الجمعية مع العديد من البروتينات الأخرى، في البشر عشرة أو أكثر، وتشكيل خطوط التجميع في الخلية لمعظم إن لم يكن جميع الوظائف الحيوية. 1 ، يتطلب 2 معارف وظيفة والهندسة المعمارية لهذه الجمعيات multiprotein تقديمها في الجودة والكمية كافية لتحليل مفصل. قلة من العديد من مجمعات البروتين في الخلايا، ولا سيما في حقيقيات النوى، ويحظر استخراجها من مصادر الأم، ويتطلب إنتاج المؤتلف. وقد ثبت التعبير نظام ناقلات الفيروسة العصوية (BEVS) أن يكون مفيدا بشكل خاص لإنتاج بروتينات حقيقية النواة، النشاط الذي عادة ما يعتمد على معالجة ما بعد متعدية التي غالبا ما يمكن لنظم التعبير الأخرى المستخدمة بشكل شائعلا يدعم. 3 BEVS استخدام باكولوفيروس المؤتلف في التي تم إدراج الجينات في المصالح لتصيب مزارع الخلايا الحشرات التي بدورها تنتج البروتين في الاختيار. MultiBac هو BEVS التي تم مصممة بشكل خاص لإنتاج مجمعات البروتين حقيقية النواة التي تحتوي على العديد من الوحدات الصغرى. 4 شرط أساسي وحيوي لكفاءة الإنتاج من البروتينات والمجمعات هم بروتوكولات قوية لجميع الخطوات المتبعة في تجربة تعبير مثالي يمكن تنفيذها في إجراءات التشغيل القياسية (إجراءات العمل الموحدة) ويليه أيضا من قبل المستخدمين غير المتخصصين مع سهولة نسبية. منصة MultiBac في مختبر علم الأحياء الجزيئي الأوروبي (EMBL) يستخدم إجراءات العمل الموحدة لجميع الخطوات المتبعة في تجربة التعبير معقدة multiprotein، بدءا من الإدراج من الجينات إلى الجينوم baculoviral هندسيا الأمثل لخصائص إنتاج البروتين مغايرة للتحليل على نطاق صغير من البروتين العينات المنتجة. 5-8 المنصةيتم تثبيت في وضع الوصول مفتوحة في EMBL غرونوبل، ودعمت العديد من العلماء من الأوساط الأكاديمية والصناعة لتسريع المشاريع البحثية المعقدة البروتين.
Introduction
يتم التحكم النشاط البيولوجي من قبل جمعيات البروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى التي تعمل في تناسق لتحفيز الوظائف الخلوية. ومن بين الأمثلة البارزة للآلية التي المحاضر المعلومات الوراثية الموجودة في الحمض النووي RNA إلى رسول. في البشر، وأكثر من 100 البروتينات معا في عملية تحديد وتنظيم لنسخ الجينات، وتشكيل المجمعات multiprotein كبيرة مع 10 وأكثر الوحدات الصغرى بما في ذلك الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني وعوامل النسخ العامة مثل TFIID، TFIIH وغيرها. 9 أمثلة أخرى هي الريبوسوم، تتكون من العديد من البروتينات وجزيئات الحمض النووي الريبي، وهذا يحفز تخليق البروتين، أو مجمع المسام النووية التي هي المسؤولة عن رحلات مكوكية الجزيئات الحيوية من خلال الغلاف النووي في حقيقيات النوى. A تشريح المعمارية والكيميائية الحيوية مفصل أساسا كافة الأجهزة المتعددة المكونات في الخلية هو أمر حيوي لفهم وظيفتها. استجلاء بنية بدائية النواة وeukarريبوسوم yotic، على سبيل المثال، شكلت الأحداث السمة المميزة الرضوخ البصيرة لم يسبق لها مثيل في كيفية هذه الآلات الجزيئات الاضطلاع بوظائفها المحددة لها في الخلية. 10،11
ويمكن الحصول على ريبوسوم في نوعية وكمية كافية لدراسة مفصلة من قبل تنقية المواد الذاتية من الخلايا المستزرعة، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن ما يصل إلى 30٪ من كتلة الخلوية تتكون من الريبوسومات. الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني هو بالفعل أقل وفرة من حيث الحجم، والعديد من ألف لتر من الخميرة الثقافة كان لا بد من معالجتها للحصول على عرض مفصل الذرية من هذا المجمع الأساسية المركزية لنسخ 12 والغالبية العظمى من المجمعات الأساسية الأخرى هي إلا موجودة في كميات أقل من ذلك بكثير في الخلايا الأم، وبالتالي لا يمكن تنقيته بشكل كاف من مصدر المواد الأصلية. لتقديم مثل هذه المجمعات في متناول التحليل البنيوي والوظيفي مفصلة يتطلب إنتاج مغاير باستخدام المؤتلف الشركة المصرية للاتصالاتchniques.
كان إنتاج البروتين المؤتلف لها تأثير كبير على بحوث علوم الحياة. تم إنتاج العديد من البروتينات recombinantly، وهيكلها وظيفة تشريح بدقة عالية. وقد اتخذت برامج الجينوميات الهيكلية الاستفادة من توضيح من الجينوم للعديد من الكائنات الحية لمعالجة ذخيرة منتج الجين من الكائنات بأكملها في وضع الإنتاجية العالية (HT). وهكذا فقد تم تحديد الآلاف من هياكل البروتين. حتى الآن، كان النظام الأكثر استخداما بغزارة لإنتاج البروتين المؤتلف E. وقد وضعت القولونية، وكثير من النظم التعبير وصقلها على مر السنين لإنتاج مغاير في هذا المضيف. البلازميدات بإيواء عدد كبير من الوظائف لتمكين إنتاج البروتين في E. القولونية ملء كتالوجات كامل من مقدمي الخدمات التجارية.
ومع ذلك، E. القولونية ديه بعض القيود التي تجعل من غير مناسبة لإنتاج العديد من البروتينات وحقيقية النواة في عمجمعات البروتين مفصلي مع العديد من الوحدات الصغرى. ولذلك، أصبح إنتاج البروتين في المضيفين حقيقية النواة على نحو متزايد الأسلوب المفضل في السنوات الأخيرة. A مناسبة بصفة خاصة نظام لإنتاج بروتينات حقيقية النواة هو تعبير نظام ناقلات الفيروسة العصوية (BEVS) التي تعتمد على باكولوفيروس المؤتلف تحمل الجينات مغاير لتصيب مزارع الخلايا الحشرات المزروعة في المختبر. نظام MultiBac هو BEVS وضعت في الآونة الأخيرة والتي يتم تفصيلها بشكل خاص لإنتاج مجمعات البروتين حقيقية النواة مع العديد من الوحدات الصغرى (الشكل 1). وقدم MultiBac الأولى في عام 2004. 13 منذ إطلاقها، وقد MultiBac تم صقلها باستمرار، ومبطنة تيار لتبسيط التعامل مع، وتحسين نوعية الهدف البروتين، وجعل النظام عموما الوصول إلى المستخدمين غير المتخصصين من خلال تصميم إجراءات التشغيل القياسية كفاءة (إجراءات العمل الموحدة). وقد تم تنفيذ 4 MultiBac في العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم، في ميلانademia والصناعة. في EMBL في غرونوبل، وضعت برامج الوصول عبر الوطنية في المكان من قبل المفوضية الأوروبية لتوفير التدريب الخبير في منصة MultiBac للعلماء الذين يرغبون في استخدام هذا النظام لدفع عجلة الإنتاج أبحاثهم. تم توضيح بنية ووظيفة عدة مجمعات البروتين التي كانت حتى الآن لا يمكن الوصول إليها باستخدام عينات المنتجة مع MultiBac. 4 في ما يلي، وتتلخص الخطوات الأساسية لإنتاج MultiBac في البروتوكولات كما هي الحال في عملية في منشأة MultiBac في EMBL غرونوبل.
Protocol
Representative Results
Discussion
فيديو الأداة الإضافية طلقات في الشكلين 2 و 3 توضيح العملية برمتها من جيل الروبوت بمساعدة من [كدنا] التعبير متعددة الجينات يبني كل وسيلة لإصابة مزارع الخلايا الحشرات لإنتاج البروتين. وقد تم تطوير الكواشف الجديدة (البلازميدات والفيروسات) والبروتوكول?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر كريستوف Bieniossek، سيمون Trowitzsch، دانيال فيتزجيرالد، يويشيرو تاكاجي، كريستيان Schaffitzel، تقول السيدة إيفون، تيموثي ريتشموند وجميع أعضاء سابقون وحاليون من المختبر بيرغر طلبا للمساعدة والمشورة. وكانت منصة MultiBac وتطوره والدعم السخي من قبل وكالات التمويل بما في ذلك المؤسسة السويسرية الوطنية للعلوم (SNSF)، ووكالة الوطني للبحوث (ANR) والمركز الوطني للبحوث العلمية (CNRS) والمفوضية الأوروبية (EC) في إطار برامج (FP) 6 و 7. يتم توفير الدعم من أجل الوصول عبر الوطنية من مشاريع FP7 EC-P CUBE ( www.p-cube.eu ) وBioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). واعترفت وزارة الفرنسية للعلوم وخاصة لدعم منصة MultiBac في EMBL من خلال INVESTISSEMENT D'أفينير مشروع FRISBI.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
- Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. The molecular sociology of the cell. Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes. Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).
- Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
- Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).
- Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production. J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).
- Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells. J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).
- Thomas, M. C., Chiang, C. M. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).
- Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. Atomic structures of the eukaryotic ribosome. Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).
- Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science. 288 (5466), 640-649 (2000).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).
- Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering. Nat. Protocols. , (2009).
- Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).
- Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, Structure of the mitotic checkpoint complex. Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).
- Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a. Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).
