La protéine plate-forme de production complexe MultiBac à l'EMBL
Summary
complexes de protéines catalysent les fonctions cellulaires essentielles. Caractérisation fonctionnelle et structurale détaillée de nombreux complexes essentielles nécessite la production recombinante. MultiBac est un système cellulaire baculovirus / insecte particulièrement adaptées pour l'expression de protéines eucaryotes et de leurs complexes. MultiBac a été mis en œuvre comme une plate-forme en libre accès, et les procédures d'exploitation normalisées développés afin de maximiser son utilité.
Abstract
La recherche en protéomique a révélé la complexité impressionnante de protéomes eucaryotes de détail sans précédent. Il est maintenant une notion communément admise que les protéines dans les cellules existent surtout pas comme des entités isolées, mais exercent leur activité biologique en association avec de nombreuses autres protéines, chez l'homme dix ou plus, formant des lignes d'assemblage dans la cellule pour la plupart, sinon toutes les fonctions vitales. 1 , 2 Connaissance de la fonction et de l'architecture de ces assemblages multiprotéiques nécessite leur disposition dans une qualité supérieure et en quantité suffisante pour une analyse détaillée. La rareté des nombreux complexes de protéines dans les cellules, en particulier chez les eucaryotes, interdit leur extraction à partir de sources indigènes, et nécessite la production recombinante. Le système de vecteur d'expression de baculovirus (BEVS) s'est avérée particulièrement utile pour produire des protéines eucaryotes, dont l'activité repose souvent sur le traitement post-traductionnelle que d'autres systèmes d'expression couramment utilisés peuvent souventpas en charge. 3 BEVS utiliser un baculovirus recombinant dans lequel le gène d'intérêt a été inséré à infecter des cultures de cellules d'insectes qui à leur tour produisent la protéine de choix. MultiBac est un BEVS qui a été particulièrement adaptée pour la production de complexes protéiques eucaryotes qui contiennent de nombreux sous-unités. 4 A condition sine qua non pour une production efficace de protéines et de leurs complexes sont des protocoles robustes pour toutes les étapes d'une expérience d'expression qui peut idéalement être mis en œuvre procédures d'utilisation normalisées (SOP) et suivie également par des utilisateurs non spécialistes avec une relative facilité. La plate-forme MultiBac au Laboratoire européen de biologie moléculaire (EMBL) utilise SOP pour toutes les étapes d'une expérience d'expression de complexes multi, à partir de l'insertion des gènes dans un génome baculoviral ingénierie optimisé pour les propriétés de production de protéines hétérologues à l'analyse à petite échelle de la protéine spécimens produits. 5-8 La plate-formeest installé dans un mode libre accès à l'EMBL de Grenoble et a soutenu de nombreux scientifiques du monde universitaire et de l'industrie pour accélérer les projets de recherche complexes protéiques.
Introduction
L'activité biologique est contrôlé par des assemblages de protéines et d'autres biomolécules qui agissent de concert pour stimuler les fonctions cellulaires. Parmi les exemples notables comprennent les machines qui transcrit l'information héréditaire contenue dans l'ADN en ARN messager. Chez l'homme, plus de 100 protéines sont réunis dans un processus défini et réglementé pour transcrire les gènes, formant de grands complexes multi avec 10 et plusieurs sous-unités dont l'ARN polymérase II et les facteurs généraux de transcription tels que TFIID, TFIIH et autres. 9 D'autres exemples sont l' ribosome, constitué de plusieurs protéines et des molécules d'ARN, qui catalyse la synthèse des protéines, ou le complexe de pore nucléaire qui est responsable de la navette biomolécules à travers l'enveloppe nucléaire chez les eucaryotes. Une dissection architectural et biochimique détaillée de la quasi-totalité des machines multi dans la cellule est essentiel de comprendre leur fonction. L'élucidation de la structure de procaryotes et eukarribosomes yotic, par exemple, constituent des événements de cachet donnant un aperçu sans précédent dans la façon dont ces machines macromoléculaires exercent leurs fonctions désignées dans la cellule. 10,11
Les ribosomes peut être obtenue en qualité et en quantité suffisante pour une étude détaillée de la purification de la matière endogène à partir de cellules en culture, en raison du fait que jusqu'à 30% de la masse cellulaire se compose de ribosomes. ARN polymérase II est déjà moins abondante par des ordres de grandeur, et plusieurs milliers de litres de culture de levure ont dû être traitées pour obtenir une vue atomique détaillée de ce complexe essentiel au cœur de la transcription. 12 L'écrasante majorité des autres complexes essentiels sont toutefois présents dans des quantités beaucoup plus faibles dans les cellules natives, et ne peuvent donc pas être purifiés de manière adéquate à partir de sources d'origine. Pour rendre ces complexes accessibles à l'analyse structurale et fonctionnelle détaillée nécessite la production hétérologue en utilisant te recombinantchniques.
Production de protéines recombinantes a eu un impact majeur sur la recherche en sciences de la vie. De nombreuses protéines ont été produites par recombinaison, et leur structure et leur fonction disséqués à haute résolution. Programmes de génomique structurale ont profité de l'élucidation de ces génomes de nombreux organismes pour s'attaquer au répertoire de produits de gènes d'organismes entiers en mode haut débit (HT). Des milliers de structures de protéines ont ainsi été déterminés. À ce jour, le système le plus prolifique utilisée pour la production de protéines recombinantes a été E. coli, et de nombreux systèmes d'expression ont été développées et affinées au fil des ans pour la production hétérologue dans cet hôte. Les plasmides hébergeant une multitude de fonctionnalités pour permettre la production de protéines dans E. coli remplir catalogues entiers de fournisseurs commerciaux.
Toutefois, E. coli a certaines limites qui la rendent impropre à produire de nombreuses protéines eucaryotes et en pcomplexes protéiques articulaires avec plusieurs sous-unités. Par conséquent, la production de protéines dans des hôtes eucaryotes est devenu de plus en plus la méthode de choix au cours des dernières années. Un système particulièrement bien adapté pour produire des protéines eucaryotes est le système de vecteur d'expression de baculovirus (BEVS) qui s'appuie sur un baculovirus recombinant portant les gènes hétérologues pour infecter des cultures de cellules d'insectes cultivées en laboratoire. Le système MultiBac est un BEVS plus récemment mis au point qui est particulièrement adaptées pour la production de complexes protéiques eucaryotes avec de nombreux sous-unités (Figure 1). MultiBac a été introduite en 2004. 13 Depuis son introduction, MultiBac a été constamment affiné et rationalisé pour simplifier la gestion, améliorer la qualité de la protéine cible et généralement rendre le système accessible à des utilisateurs non spécialistes de la conception des procédures d'exploitation normalisées efficaces (SOP). 4 MultiBac a été mis en place dans de nombreux laboratoires du monde entier, en acAdemia et de l'industrie. A l'EMBL à Grenoble, les programmes d'accès transnationaux ont été mis en place par la Commission européenne pour fournir une formation spécialisée sur la plateforme MultiBac pour les scientifiques qui souhaitent utiliser ce système de production pour faire avancer leurs recherches. La structure et la fonction de nombreux complexes protéiques qui n'étaient jusque-là pas accessible a été élucidée à l'aide d'échantillons produits avec MultiBac. 4 Dans la suite, les étapes essentielles de la production MultiBac sont résumées dans les protocoles qu'ils sont en opération à l'installation MultiBac à l'EMBL de Grenoble.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vidéo instantanés sur les figures 2 et 3 illustrent l'ensemble du processus de production assistée par robot à partir d'ADNc d'expression multigénique construit tout le chemin à l'infection des cultures de cellules d'insectes pour la production de protéines. Nouveaux réactifs (plasmides et virus) et les protocoles robustes ont été développés pour permettre une conduite en s'appuyant sur SOP. L'ensemble du pipeline a été mis en œuvre comme une t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond et à tous les membres passés et présents du laboratoire Berger de l'aide et des conseils. La plate-forme MultiBac et son développement ont été et sont généreusement financés par des organismes de financement, notamment le Fonds national suisse (FNS), l'Agence Nationale de Recherche (ANR) et le Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) et la Commission européenne (CE) dans les programmes-cadres (PC) 6 et 7. Soutien à l'accès transnational est fourni par les projets du 7e PC CE P-CUBE ( www.p-cube.eu ) et BioSTRUCT-X ( www.biostruct-x.eu ). Le ministère français des sciences est particulièrement reconnu pour soutenir la plate-forme MultiBac à l'EMBL à travers l'Investissement d'Avenir projet FRISBI.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
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