Method Article

La protéine plate-forme de production complexe MultiBac à l'EMBL

DOI:

10.3791/50159

July 11th, 2013

In This Article

Summary

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complexes de protéines catalysent les fonctions cellulaires essentielles. Caractérisation fonctionnelle et structurale détaillée de nombreux complexes essentielles nécessite la production recombinante. MultiBac est un système cellulaire baculovirus / insecte particulièrement adaptées pour l'expression de protéines eucaryotes et de leurs complexes. MultiBac a été mis en œuvre comme une plate-forme en libre accès, et les procédures d'exploitation normalisées développés afin de maximiser son utilité.

Abstract

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La recherche en protéomique a révélé la complexité impressionnante de protéomes eucaryotes de détail sans précédent. Il est maintenant une notion communément admise que les protéines dans les cellules existent surtout pas comme des entités isolées, mais exercent leur activité biologique en association avec de nombreuses autres protéines, chez l'homme dix ou plus, formant des lignes d'assemblage dans la cellule pour la plupart, sinon toutes les fonctions vitales. 1 , 2 Connaissance de la fonction et de l'architecture de ces assemblages multiprotéiques nécessite leur disposition dans une qualité supérieure et en quantité suffisante pour une analyse détaillée. La rareté des nombreux complexes de protéines dans les cellules, en particulier chez les eucaryotes, interdit leur extraction à partir de sources indigènes, et nécessite la production recombinante. Le système de vecteur d'expression de baculovirus (BEVS) s'est avérée particulièrement utile pour produire des protéines eucaryotes, dont l'activité repose souvent sur le traitement post-traductionnelle que d'autres systèmes d'expression couramment utilisés peuvent souventpas en charge. 3 BEVS utiliser un baculovirus recombinant dans lequel le gène d'intérêt a été inséré à infecter des cultures de cellules d'insectes qui à leur tour produisent la protéine de choix. MultiBac est un BEVS qui a été particulièrement adaptée pour la production de complexes protéiques eucaryotes qui contiennent de nombreux sous-unités. 4 A condition sine qua non pour une production efficace de protéines et de leurs complexes sont des protocoles robustes pour toutes les étapes d'une expérience d'expression qui peut idéalement être mis en œuvre procédures d'utilisation normalisées (SOP) et suivie également par des utilisateurs non spécialistes avec une relative facilité. La plate-forme MultiBac au Laboratoire européen de biologie moléculaire (EMBL) utilise SOP pour toutes les étapes d'une expérience d'expression de complexes multi, à partir de l'insertion des gènes dans un génome baculoviral ingénierie optimisé pour les propriétés de production de protéines hétérologues à l'analyse à petite échelle de la protéine spécimens produits. 5-8 La plate-formeest installé dans un mode libre accès à l'EMBL de Grenoble et a soutenu de nombreux scientifiques du monde universitaire et de l'industrie pour accélérer les projets de recherche complexes protéiques.

Introduction

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L'activité biologique est contrôlé par des assemblages de protéines et d'autres biomolécules qui agissent de concert pour stimuler les fonctions cellulaires. Parmi les exemples notables comprennent les machines qui transcrit l'information héréditaire contenue dans l'ADN en ARN messager. Chez l'homme, plus de 100 protéines sont réunis dans un processus défini et réglementé pour transcrire les gènes, formant de grands complexes multi avec 10 et plusieurs sous-unités dont l'ARN polymérase II et les facteurs généraux de transcription tels que TFIID, TFIIH et autres. 9 D'autres exemples sont l' ribosome, constitué de plusieurs pr....

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Protocol

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1. Tandem recombineering (TR) pour créer des constructions d'expression multigénique

  1. Planification de la stratégie de co-expression. approche de conception pour insérer vos gènes d'intérêt en donneurs et accepteurs. Sous-modules physiologiques potentiels de votre complexe doivent être regroupés sur accepteurs et donneurs spécifiques. Utilisez module de multiplication composée de endonucléase Homing (HE) - paires BstXI de combiner des cassettes d'expression sur différents donateurs et des plasmides d'accepteurs 7,8 Créer toutes les constructions pertinentes in silico et valider la stratégie complètement a....

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Results

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Co-expression forte de protéines hétérologues obtenus par le système MultiBac est illustré à la figure 1d (sondes prises 48 heures après l'infection d'une culture de cellules en suspension). Les bandes de protéine surexprimée est clairement perceptible dans l'ensemble extrait cellulaire (SNP) et le lysat clarifié (SN). La qualité et la quantité de la matière protéique produite est souvent suffisante pour permettre la détermination de la structure des complexes de protéines, telles que le point de contrô.......

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Discussion

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Vidéo instantanés sur les figures 2 et 3 illustrent l'ensemble du processus de production assistée par robot à partir d'ADNc d'expression multigénique construit tout le chemin à l'infection des cultures de cellules d'insectes pour la production de protéines. Nouveaux réactifs (plasmides et virus) et les protocoles robustes ont été développés pour permettre une conduite en s'appuyant sur SOP. L'ensemble du pipeline a été mis en œuvre comme une technologie de p.......

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Disclosures

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IB est l'inventeur sur les brevets et demandes de brevet décrivant les pièces de la technologie décrite ici.

Acknowledgements

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Nous remercions Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond et à tous les membres passés et présents du laboratoire Berger de l'aide et des conseils. La plate-forme MultiBac et son développement ont été et sont généreusement financés par des organismes de financement, notamment le Fonds national suisse (FNS), l'Agence Nationale de Recherche (ANR) et le Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) et la Commission européenne (CE) dans les programmes-cadres (PC) 6 et 7. Soutien à l'accès transnational est fourni par les projets du 7e PC CE P-CUBE (

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bluo-GalInvitrogen15519-028 (1 g)
TétracyclineEuromedexUT2965-B (25 g)1 000X à 10 mg/ml
KanamycineEuromedexEU0420 (25 g)1 000X à 50 mg/ml
GentamycineSIGMAG3632 (5 g)1 000X à 10 mg/ml
IPTGEuromedexEU0008-B (5 g)1 000X à 1 M
Cre-recombinaseNew England BioLabsM0298
X-Treme GENE HP réactif de transfectionRoche06 366 236 001
Hyclone SFM4 InsectThermo ScientificSH 30913.02
Plaque 6 puits FalconDominique Dutscher353046
pipette de 2 ml FalconDominique Dutscher357507
pipette de 5 ml FalconDominique Dutscher357543
pipette 10 ml FalconDominique Dutscher357551
pipette 25 ml FalconDominique Dutscher357535
pipette 50 ml FalconDominique Dutscher357550
tube de 50 ml FalconDominique Dutscher352070
tube de 15 ml FalconDominique Dutscher
Flacon cryotube NuncDominique Dutscher55005
100 ml Shaker211917Dutscher
Shaker 250 ml PyrexDominique Dutscher
500 ml PyrexDominique Dutscher211919
Shaker 2 L Shaker PyrexDominique Dutscher
Certomat Agitateur orbital + plateauSartorius4445110, 4445233
Réservoir d’azote liquide dewar 35 LFisher ScientificM76801
Armoire de sécurité biologique FasterSodiproFASV20000606
Sf21 Cellules
Hi5 Cellules d’insectesInvitrogenB855-02
Tecan freedom EVO running Evoware plusTECAN
10 &mu ; l embouts conducteurs (noir),TECAN10 612 516
200 &mu ; l embouts conducteurs (noir)TECAN10 612 510
Auge jetable pour réactifs, 100 mlTECAN10 613 049
twin.tec Plaque PCR 96, jupeEppendorf0030 128.648
96 puits V fond, non stérileBD falcon353263
96 plaque deepwell couleur naturel, PP)FisherM3752M
Microplaque PS, 96 puits fond platGreiner655101
96 plaque de puitsprofond Thermo scientificAB-0932
24 blocs de puits RBQiagen19583
DpnI enzyme de restrictionNEBR0176L20 U/uL
NEBuffer 4 10XNEBB7004S
2X phusion mastermix HFFinnzymeref F-531L
2X phusion mastermix GCFinnzymeref F-532L
DGLB 1.5Xfait maison7.5 % glycérol, 0.031 % bleu de bromophénol, 0.031 % Xylène cyanol FF
Échelle de masse à haute masse d’ADN pour e-gelLife Technologies10496-016
Échelle de masse à faible ADN pour e-gelLife Technologies10068-013
E-gel 48 1 % agarose GPLife TechnologiesG8008-01
Nucleo Spin- robot-96 plasmide kitMacherey Nagel740 708.24
Kit de nettoyage PCR, Nucleospin Robot-96 ExtractMacherey Nagel740 707.2
Gotaq green master mixPromegaM7113
T4 ADN polymérase, qualifié LICNovagen70099-3
DTT 100 mMfait maison
Urée 2 MEDTA maison
500 mM pH 8.0Bouillon LB maison
(Miller) 500 gAthena ES103
352096 250 ml Pyrex Dominique 211918 211921 Microscope optique Zeiss 451207 d’insectes

References

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
  2. Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. The molecular sociology of the cell. Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).
  3. Kost, T. A., Condreay,....

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MultiBac PlatformProtein Complex ProductionBaculovirus Expression SystemInsect Cell CultureStandard Operating ProceduresGene Construct AssemblyViral Genome IsolationProtein Purification MethodsStructural Analysis TechniquesDrug Discovery Applications

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