EMBL में MultiBac प्रोटीन परिसर उत्पादन प्लेटफार्म
Summary
प्रोटीन परिसरों प्रमुख सेलुलर कार्यों उत्प्रेरित. कई आवश्यक परिसरों की विस्तृत कार्यात्मक और संरचनात्मक लक्षण वर्णन पुनः संयोजक उत्पादन की आवश्यकता है. MultiBac विशेष रूप यूकेरियोटिक प्रोटीन और उनके परिसरों व्यक्त करने के लिए सिलवाया एक baculovirus / कीट सेल प्रणाली है. MultiBac एक खुला मंच का उपयोग, और इसकी उपयोगिता को अधिकतम करने के लिए विकसित मानक संचालन प्रक्रिया के रूप में लागू किया गया था.
Abstract
Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.
Introduction
जैविक गतिविधि प्रोटीन और सेलुलर कार्यों को उत्प्रेरित करने के लिए संगीत कार्यक्रम में कार्य करने वाले अन्य biomolecules की विधानसभाओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है. उल्लेखनीय उदाहरण दूत शाही सेना में डीएनए में निहित वंशानुगत जानकारी transcribes कि मशीनरी शामिल हैं. मनुष्यों में, 100 से ज्यादा प्रोटीन होते हैं आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय और ऐसे TFIID, TFIIH और दूसरों के रूप में सामान्य प्रतिलेखन कारक है. 9 अन्य उदाहरणों सहित 10 और अधिक यूनिटों के साथ बड़े multiprotein परिसरों के गठन, जीन टाइप करने के लिए एक परिभाषित और विनियमित प्रक्रिया में एक साथ आते हैं राइबोसोम, प्रोटीन संश्लेषण, या eukaryotes में परमाणु लिफाफा के माध्यम से biomolecules के चक्कर के लिए जिम्मेदार है जो परमाणु ताकना जटिल catalyzes कि कई प्रोटीन और आरएनए अणुओं से मिलकर. सेल में अनिवार्य रूप से सभी multicomponent मशीनों की एक विस्तृत वास्तु और जैव रासायनिक विच्छेदन उनके कार्य को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रोकार्योटिक और eukar की संरचना व्याख्याyotic राइबोसोम, उदाहरण के लिए, इन macromolecular मशीनों सेल में अपने निर्दिष्ट कार्यों को पूरा कैसे में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि उपज बानगी घटनाओं का गठन किया. 10,11
राइबोसोम ऊपर सेलुलर द्रव्यमान का 30% करने के लिए राइबोसोम के होते हैं कि इस तथ्य के कारण संवर्धित कोशिकाओं से अंतर्जात सामग्री, सफ़ाई द्वारा विस्तृत अध्ययन के लिए पर्याप्त गुणवत्ता और मात्रा में प्राप्त किया जा सकता है. शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय अन्य आवश्यक परिसरों की भारी बहुमत में फिर भी मौजूद हैं, जो पहले से ही खमीर संस्कृति के कम परिमाण के आदेश से प्रचुर मात्रा में है, और कई हजार लीटर है प्रतिलेखन के लिए केंद्रीय इस आवश्यक परिसर की एक विस्तृत परमाणु दृश्य प्राप्त करने के लिए संसाधित किया जा सकता था. 12 इस प्रकार देशी कोशिकाओं, और में बहुत कम मात्रा में देशी स्रोत सामग्री से पर्याप्त रूप से शुद्ध नहीं किया जा सकता. विस्तृत संरचनात्मक और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए सुलभ ऐसे परिसरों रेंडर करने के लिए पुनः संयोजक ते का उपयोग करके heterologous उत्पादन की आवश्यकताchniques.
पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन को जीवन विज्ञान अनुसंधान पर एक बड़ा प्रभाव था. कई प्रोटीन recombinantly उत्पादन किया, और उनकी संरचना और समारोह के उच्च संकल्प पर विच्छेदित किए गए. स्ट्रक्चरल जीनोमिक्स कार्यक्रमों उच्च throughput (हिंदुस्तान टाइम्स) मोड में संपूर्ण जीवों के जीन उत्पाद प्रदर्शनों की सूची को संबोधित करने के लिए कई जीवों के जीनोम की व्याख्या का लाभ ले लिया है. प्रोटीन संरचनाओं के हजारों इस प्रकार निर्धारित किया गया है. तिथि करने के लिए, पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए सबसे prolifically इस्तेमाल किया प्रणाली ई. किया गया है कोली, और कई अभिव्यक्ति सिस्टम इस मेजबानी में heterologous उत्पादन के लिए पिछले कुछ वर्षों में विकसित और परिष्कृत किया गया है. ई. में प्रोटीन के उत्पादन को सक्षम करने के functionalities के ढेर सारे शरण प्लास्मिडों कोली वाणिज्यिक प्रदाताओं की पूरी सूची भरें.
हालांकि, ई. कोली कई यूकेरियोटिक प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए यह अनुपयुक्त है जो कुछ सीमाएं हैं और पी मेंकई यूनिटों के साथ जोड़ प्रोटीन परिसरों. इसलिए, यूकेरियोटिक मेजबान में प्रोटीन के उत्पादन को तेजी से हाल के वर्षों में चुनाव का तरीका बन गया है. यूकेरियोटिक प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए एक विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल प्रणाली प्रयोगशाला में खेती कीट सेल संस्कृतियों को संक्रमित करने heterologous जीन ले एक पुनः संयोजक baculovirus पर निर्भर करता है कि baculovirus अभिव्यक्ति वेक्टर प्रणाली (BEVs) है. MultiBac प्रणाली विशेष रूप से कई यूनिटों (चित्रा 1) के साथ यूकेरियोटिक प्रोटीन परिसरों के उत्पादन के लिए बनाया गया है, जो एक और अधिक हाल ही में विकसित BEVs है. MultiBac पहली बार 2004 में शुरू की गई थी. 13 अपनी शुरुआत के बाद से, MultiBac लगातार परिष्कृत किया गया है और, हैंडलिंग सरल बनाने के लक्ष्य प्रोटीन की गुणवत्ता में सुधार और आम तौर पर कुशल मानक संचालन प्रक्रिया (रियायतों) डिजाइन द्वारा गैर विशेषज्ञ उपयोगकर्ताओं के लिए व्यवस्था सुलभ बनाने के लिए धारा खड़े हैं. 4 MultiBac एसी में, दुनिया भर में व्यापक कई प्रयोगशालाओं में लागू किया गया हैademia और उद्योग. ग्रेनोबल में EMBL में, अंतरराष्ट्रीय पहुंच कार्यक्रमों उनके अनुसंधान को आगे बढ़ाने के लिए इस उत्पादन प्रणाली का उपयोग करने के लिए कामना की है जो वैज्ञानिकों के लिए MultiBac मंच पर विशेषज्ञ प्रशिक्षण प्रदान करने के लिए यूरोपीय आयोग द्वारा जगह में डाल रहे थे. वे EMBL ग्रेनोबल में MultiBac सुविधा पर चल रही हैं के रूप में अब तक सुलभ नहीं थे कि कई प्रोटीन परिसरों की संरचना और समारोह MultiBac के साथ उत्पादन के नमूनों का उपयोग करके स्पष्ट किया गया था. 4 बाद में, MultiBac उत्पादन के लिए आवश्यक कदम प्रोटोकॉल में संक्षेप हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
आंकड़े 2 और 3 में वीडियो तस्वीर शॉट्स बहुजीनीय अभिव्यक्ति की सीडीएनए से रोबोट की मदद से पीढ़ी से पूरी प्रक्रिया को वर्णन प्रोटीन के उत्पादन के लिए कीट सेल संस्कृतियों के संक्रमण के लिए सभी …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम क्रिस्टोफ Bieniossek, साइमन Trowitzsch, डैनियल फिजराल्ड़, Yuichiro Takagi, क्रिस्टियन Schaffitzel, युवान Hunziker, टिमोथी रिचमंड और मदद और सलाह के लिए बर्गर प्रयोगशाला के सभी पूर्व और वर्तमान सदस्यों को धन्यवाद. MultiBac मंच और इसके विकास के लिए किया गया है और उदारता से स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (SNSF), एजेंस राष्ट्रीय डी Recherche (ANR) और केंद्र में राष्ट्रीय डी Recherche Scientifique (CNRS) और यूरोपीय आयोग (ईसी) सहित आर्थिक सहायता एजेंसियों द्वारा समर्थित हैं फ्रेमवर्क कार्यक्रमों में (एफपी) 6 और 7. अंतरराष्ट्रीय पहुंच के लिए समर्थन ईसी परियोजनाओं FP7 पी घन (द्वारा प्रदान की गई है www.p-cube.eu ) और BioStruct एक्स ( www.biostruct-x.eu ). विज्ञान के फ्रेंच मंत्रालय विशेषकर Investissement डी Avenir परियोजना FRISBI माध्यम EMBL में MultiBac मंच का समर्थन करने के लिए स्वीकार किया है.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
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