Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL
Summary
Complessi proteici catalizzano le funzioni cellulari fondamentali. Caratterizzazione funzionale e strutturale dettagliata di molti complessi essenziali richiede la produzione ricombinante. MultiBac è un sistema di celle di baculovirus / insetto particolarmente adattato per esprimere proteine eucariotiche e dei loro complessi. MultiBac è stato implementato come una piattaforma open-access, e le procedure operative standard sviluppati per massimizzare la sua utilità.
Abstract
Ricerca proteomica ha rivelato l'impressionante complessità del proteoma eucariotiche in dettaglio senza precedenti. Ora è un concetto comunemente accettato che le proteine nelle cellule esistono per lo più non come entità isolate, ma esercitano la loro attività biologica in collaborazione con molte altre proteine, nell'uomo dieci o più, formando catene di montaggio della cella per la maggior parte se non tutte le funzioni vitali. 1 , 2 Conoscenza della funzione e l'architettura di queste assemblee multiproteici richiede la loro disposizione in una qualità superiore e la quantità sufficiente per l'analisi dettagliata. La scarsità di molti complessi proteina nelle cellule, in particolare negli eucarioti, vieta loro estrazione da fonti native, e richiede la produzione ricombinante. Il sistema di vettore di espressione di baculovirus (BEVS) ha dimostrato di essere particolarmente utile per produrre proteine eucariotiche, la cui attività si basa spesso su elaborazione post-traduzionale che altri sistemi di espressione comunemente usati spesso puònon supportano. 3 BEVS utilizzare un baculovirus ricombinante in cui è stato inserito il gene di interesse per infettare colture cellulari di insetto che a loro volta producono la proteina di scelta. MultiBac è un BEVS che è stato particolarmente su misura per la produzione di complessi di proteine eucariotiche che contengono molte subunità. 4 Un prerequisito fondamentale per una produzione efficiente di proteine e loro complessi sono protocolli affidabili per tutte le fasi coinvolte in un esperimento di espressione che idealmente può essere implementato come procedure operative standard (SOP) e seguito anche da utenti non specializzati con relativa facilità. La piattaforma MultiBac al Laboratorio europeo di biologia molecolare (EMBL) utilizza POS per tutti i passaggi necessari per un multiprotein esperimento un'espressione complessa, a partire dalle inserimento dei geni in un genoma baculoviral ingegnerizzato ottimizzato per la produzione di proteine eterologhe proprietà di analisi su scala ridotta della proteina esemplari prodotti. 5-8 La piattaforma diè installato in una modalità di accesso aperto presso l'EMBL di Grenoble e ha supportato molti scienziati del mondo accademico e industria per accelerare i progetti di ricerca complessi proteici.
Introduction
Attività biologica è controllata da gruppi di proteine e altre biomolecole che agiscono di concerto per catalizzare le funzioni cellulari. Tipici esempi sono i macchinari che trascrive l'informazione ereditaria contenuta nel DNA in RNA messaggero. Negli esseri umani, più di 100 proteine si uniscono in un processo definito e disciplinato a trascrivere i geni, formando grandi complessi multiproteici con 10 e più subunità tra RNA polimerasi II e dei fattori di trascrizione generali come TFIID, TFIIH e altri. 9 Altri esempi sono il ribosoma, composto di molte proteine e molecole di RNA, che catalizza la sintesi proteica, o il complesso nucleare del poro che è responsabile della spola biomolecole attraverso la membrana nucleare negli eucarioti. Una dissezione dettagliata architettonico e biochimici di sostanza, tutte le macchine multicomponente nella cella è fondamentale per capire la loro funzione. La delucidazione struttura dei procarioti e eukarribosomi yotic, per esempio, costituivano eventi caratteristici che producono visione senza precedenti di come queste macchine macromolecolari svolgere le loro funzioni indicate nella cella. 10,11
Ribosomi possono essere ottenuti in qualità e quantità sufficiente per studio dettagliato purificando il materiale endogeno da cellule in coltura, dovuta al fatto che fino al 30% della massa cellulare consiste di ribosomi. RNA polimerasi II è già meno abbondante di ordini di grandezza, e molte migliaia di litri di coltura di lievito dovevano essere elaborati per ottenere una dettagliata vista atomico di questo complesso essenziale centrale per la trascrizione. 12 La stragrande maggioranza degli altri complessi essenziali sono comunque presenti in molto più bassi importi in cellule native, e quindi non possono essere adeguatamente purificati da materiale di origine nativa. Per rendere tali complessi accessibili per l'analisi strutturale e funzionale dettagliata richiede produzione eterologa mediante te ricombinantechniques.
Produzione di proteina ricombinante ha avuto un grande impatto sulla ricerca di scienze biologiche. Molte proteine sono state prodotte ricombinante, e la loro struttura e funzione sezionati ad alta risoluzione. Programmi di genomica strutturale hanno approfittato della delucidazione dei genomi di molti organismi per affrontare il gene prodotto repertorio di interi organismi in modalità high-throughput (HT). Migliaia di strutture proteiche sono state così determinato. Ad oggi, il sistema più prolifico utilizzato per la produzione di proteina ricombinante è stata E. coli, e molti sistemi di espressione sono stati sviluppati e perfezionati nel corso degli anni per la produzione di eterologa in questo host. I plasmidi che ospitano un gran numero di funzionalità per consentire la produzione di proteine in E. coli riempiono interi cataloghi di fornitori commerciali.
Tuttavia, E. coli ha alcune limitazioni che rendono non adatti per produrre molte proteine eucariotiche e in pcomplessi proteici articolari con molte subunità. Pertanto, la produzione di proteine in ospiti eucariotici è diventata sempre il metodo di scelta negli ultimi anni. Un sistema particolarmente idoneo per produrre proteine eucariotiche è il sistema di vettore di espressione di baculovirus (BEVS) che si basa su un baculovirus ricombinante che trasportano i geni eterologhi per infettare colture di cellule di insetto coltivate in laboratorio. Il sistema è un MultiBac BEVS recentemente sviluppate, particolarmente su misura per la produzione di complessi proteici eucariotiche con molte subunità (Figura 1). MultiBac è stato introdotto nel 2004. 13 Dalla sua introduzione, MultiBac è stato continuamente perfezionato e snella per semplificare la gestione, migliorare la qualità delle proteine bersaglio e in generale rendere il sistema accessibile agli utenti non specialisti per la progettazione di procedure operative standard (SOP efficienti). 4 MultiBac è stato implementato in molti laboratori in tutto il mondo, in academia e industria. Alla EMBL di Grenoble, programmi di accesso transnazionali sono state messe in atto dalla Commissione europea per fornire formazione di esperti presso la piattaforma MultiBac per gli scienziati che hanno voluto utilizzare questo sistema di produzione per far progredire la loro ricerca. La struttura e la funzione di molti complessi proteici che erano fino a quel momento non accessibile è stato spiegato, utilizzando campioni prodotti con MultiBac. 4 Nel seguito, le fasi essenziali della produzione MultiBac sono riassunti in protocolli come sono in funzione presso l'impianto MultiBac presso l'EMBL di Grenoble.
Protocol
Representative Results
Discussion
Video istantanee delle figure 2 e 3 illustrano l'intero processo di generazione robot-assistita da cDNA di espressione multigene costruisce fino alla infezione di colture cellulari di insetto per la produzione di proteine. Nuovi reagenti (plasmidi e virus) e protocolli robusti sono stati sviluppati per consentire una pipeline basandosi su SOP. L'intera filiera è stato implementato come una piattaforma tecnologica al EMBL di Grenoble. La piattaforma MultiBac è stata letta da mo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond e tutti i membri passati e presenti del laboratorio Berger per assistenza e consulenza. La piattaforma MultiBac e il suo sviluppo sono stati e sono generosamente sostenuto da enti finanziatori tra cui il Fondo nazionale svizzero (FNS), l'Agence National de Recherche (ANR) e del Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) e la Commissione europea (CE) ai programmi quadro (PQ), 6 e 7. Il supporto per l'accesso transnazionale è fornito dai progetti 7 ° PQ CE P-CUBE ( www.p-cube.eu ) e BioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). Il Ministero della Scienza francese è particolarmente riconosciuto per sostenere la piattaforma MultiBac al EMBL attraverso l'Investissement d'Avenir progetto FRISBI.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
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