EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu
Summary
Protein kompleksleri önemli hücre fonksiyonlarını katalize eder. Birçok temel komplekslerinin detaylı fonksiyonel ve yapısal karakterizasyonu rekombinant üretimi gerektirir. MultiBac özellikle ökaryotik protein ve kompleksleri ifade etmek için özel bir bakülovirüs / böcek hücre sistemidir. MultiBac açık erişim platformu ve faydayı maksimize için geliştirilmiş standart çalışma prosedürleri olarak uygulanmıştır.
Abstract
Proteomics araştırmalar benzeri görülmemiş ayrıntılı olarak ökaryot proteomlarda etkileyici karmaşıklığı ortaya çıkardı. Şimdi hücrelerdeki protein soyutlanan varlıklar olarak değil var ama çoğu değilse tüm hayati fonksiyonları için hücrede montaj hatları oluşturan, insanlar on veya daha fazla, pek çok diğer proteinler ile birlikte biyolojik aktivite uygulamayın bir genel kabul gören bir kavramdır. 1 , bu multiprotein meclislerin işlevi ve mimarisi 2 Bilgi detaylı analiz için üstün kalite ve yeterli miktarda kendi ayrılmasını gerektiren. Hücreleri içinde birçok protein kompleksleri yetersizliği, ökaryotlarda, özellikle doğal kaynaklardan ekstraksiyon yasaklar, ve rekombinant üretim gerektirir. Bakulovirüs ekspresyon vektör sistemi (BEVs) ökaryotik proteinler üretmek için özellikle yararlı olduğu kanıtlanmıştır, ve aktivite genellikle translasyon sonrası işleme dayanan yaygın olarak kullanılan diğer ekspresyon sistemleri genellikle mümkün olduğudesteklemez. 3 BEVs ilgilenilen genin da tercih edilen bir proteini üretmek böcek hücresi kültürleri enfekte içine eklenmiş bir rekombinan bakulovirüs kullanın. MultiBac özellikle birçok alt birimleri içeren ökaryotik protein kompleksleri üretimi için özel olan bir BEVs olduğunu. 4 verimli proteinlerin üretimi ve kompleksleri için hayati bir ön koşul ideal olarak uygulanabilir bir ifade deneyde ilgili tüm adımlar için sağlam protokolleri standart operasyon prosedürleri (SOP) ve karşılaştırmalı kolaylıkla uzman olmayan kullanıcılar tarafından da takip. Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuarı (EMBL) de platformun MultiBac proteinin küçük ölçekli analizlerine heterolog protein üretimi özellikleri için optimize edilmiş bir mühendislik bakuloviral genlerin genomun içine sokulmasını başlayarak, bir multiprotein karmaşık ifade deney ile ilgili tüm adımlar için SOP kullanır üretilen numuneler. 5-8 platformuEMBL Grenoble bir açık erişim modunda yüklenir ve akademi ve protein kompleksi araştırma projeleri hızlandırmak için sanayiden birçok bilim adamı desteklemiştir.
Introduction
Biyolojik aktivite protein ve hücresel fonksiyonları katalize uyum içinde hareket diğer biyomoleküllerin meclisleri tarafından kontrol edilir. Önemli örnekler mesajcı RNA DNA bulunan kalıtsal bilgi transkripsiyonun makine içerir. İnsanlarda, 100'den fazla protein olan RNA polimeraz II ve bu TFIID, ve diğerleri gibi TFIIH genel transkripsiyon faktörlerini içerir. 9 Diğer örnekler de dahil olmak üzere 10 ve daha fazla alt-birimleri ile büyük multiprotein kompleksleri oluşturarak, gen transkripsiyonu için bir tanımlanmış ve regülasyonuyla bir araya gelip ribozom, protein sentezi, ya da ökaryotlarda çekirdek zarı yoluyla biyomoleküllerin mekik sorumludur nükleer gözenek kompleks katalize birçok protein ve RNA molekülleri arasında oluşur. Hücrede aslında tüm bileşenli makineleri ayrıntılı bir mimari ve biyokimyasal diseksiyon işlevlerini anlamak için çok önemlidir. Prokaryotik ve eukar yapısı aydınlatılmasıyotic ribozomlar, örneğin, bu makromoleküler makineleri hücre n belirlenen işlevlerini yerine nasıl içine görülmemiş fikir veren damgasını olaylar oluşturmuştur. 10,11
Ribozomlar hücre kütlesinin% 30'u ribozomların oluşması nedeniyle, kültürlenmiş hücrelerden endojen malzeme saflaştırılmasıyla detaylı bir çalışma için yeterli kalitede ve miktarda elde edilebilir. RNA polimeraz II diğer önemli kompleksler ezici çoğunluğu ancak mevcut zaten maya kültürü daha az büyüklükte siparişleri ile bol ve birçok bin litredir transkripsiyon merkezi bu temel karmaşık ayrıntılı bir atom görünümü elde etmek için işlenecek vardı. 12 böylece yerli hücrelerinde olmuş, ve çok daha düşük miktarda yerel kaynak malzemeden yeterli saflaştırılmış edilemez. Ayrıntılı yapısal ve fonksiyonel analiz için erişilebilir bu tür kompleksleri işlemek için rekombinant te kullanarak heterolog üretim gerektirirchniques.
Rekombinant protein üretimi yaşam bilim araştırma üzerinde önemli bir etkisi vardı. Birçok protein yeniden birleştirilerek üretilen ve kendi yapısı ve işlevi yüksek çözünürlükte disseke edildi. Yapısal genomik programları yüksek verimli (HT) modda tüm organizmaların gen ürünü repertuar yönelik birçok organizmaların genomları en aydınlatılması yararlanmaktadır. Protein yapılarının Binlerce böylece belirlenmiştir. Bugüne kadar, yeniden birleştirici protein üretimi için en çok üretken kullanılan sistem E. olmuştur coli ve birçok ekspresyon sistemleri bu ev sahibi heterolog üretimi için yılda gelişmiş ve rafine edilmiştir. E. protein üretimini sağlamak için işlevleri bir bolluk barındıran plazmid coli ticari sağlayıcılarının tüm katalogları doldurun.
Bununla birlikte, E. coli birçok ökaryotik protein üretmek için uygun yapmak bazı sınırlamaları vardır ve pçok sayıda alt-birimleri ile eklem protein kompleksleri. Bu nedenle, ökaryotik ana protein üretimi giderek son yıllarda tercih edilen yöntem haline gelmiştir. Ökaryotik proteinler üretmek için özellikle çok uygun sistem laboratuarda yetiştirilir böcek hücresi kültürleri bulaştırmak için, heterolog genleri taşıyan bir rekombinan bakulovirüs dayanır bakulovirüs ekspresyon vektörü sistemine (BEVs) 'dir. MultiBac sistem özellikle birçok alt birimden (Şekil 1) ile ökaryotik protein komplekslerinin üretimi için uygun olan, daha yakın zamanda geliştirilmiş BEVs olup. MultiBac ilk olarak 2004 yılında tanıtıldı. 13 tanıtılmasından bu yana, MultiBac sürekli geliştirildi ve kullanımı kolaylaştırmak hedef protein kalitesini artırmak ve genel olarak verimli standart operasyon prosedürleri (SOP) tasarlayarak uzman olmayan kullanıcılar için sistem erişilebilir hale getirmek için dere-astarlı. 4 MultiBac ac içinde, dünya çapında birçok laboratuvarda uygulamaya konmuşturademia ve sanayi. Grenoble EMBL de, uluslararası erişim programları araştırma ilerleyen bu üretim sistemi kullanmak isteyen bilim adamları için MultiBac platformda uzman eğitim vermek için Avrupa Komisyonu tarafından uygulamaya konuldu. Onlar EMBL Grenoble de MultiBac tesisinde operasyonda olduğu gibi şimdiye kadar erişilebilir değildi birçok protein komplekslerinin yapısı ve fonksiyonu MultiBac ile üretilen numuneler kullanılarak aydınlatıldı. 4 Aşağıda, MultiBac üretim önemli adımlar protokolleri özetlenmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Şekiller 2 ve 3'te ek video görüntüleri çoklu gen ifade cDNA'dan robot yardımıyla kuşaktan tüm süreci gösteren protein üretimi için bir böcek hücresi kültürlerinin enfeksiyon tüm yol oluşturur. Yeni reaktifler (plazmid ve virüs) ve sağlam protokolleri SOPler dayanarak bir boru hattı sağlamak için geliştirilmiştir. Tüm boru hattı Grenoble EMBL bir platform teknolojisi olarak uygulamaya konmuştur. MultiBac platformu multiprotein araştırma yapan akade…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond ve yardım ve tavsiye için Berger laboratuar tüm geçmiş ve mevcut üyelerine teşekkür. MultiBac platformu ve gelişimi olmuştur ve cömertçe İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNSF), Agence National de Recherche (ANR) ve Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) ve Avrupa Komisyonu (AK) dahil olmak üzere finansman kurumları tarafından desteklenmektedir Çerçeve programlarına (FP) 6 ve 7. Uluslararası erişim desteği AB FP7 projeleri P-CUBE (tarafından sağlanan www.p-cube.eu ) ve BioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). Bilim Fransız Bakanlığı özellikle Investissement d'Avenir projesi FRISBI yoluyla EMBL de MultiBac platformu desteklemek için kabul edilmektedir.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
- Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. The molecular sociology of the cell. Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes. Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).
- Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
- Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).
- Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production. J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).
- Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells. J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).
- Thomas, M. C., Chiang, C. M. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).
- Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. Atomic structures of the eukaryotic ribosome. Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).
- Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science. 288 (5466), 640-649 (2000).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).
- Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering. Nat. Protocols. , (2009).
- Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).
- Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, Structure of the mitotic checkpoint complex. Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).
- Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a. Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).
