Mikrobiyal Systems Biyoloji Chemostats Kullanımı
Summary
Hücre büyüme oranı düzenlenmiş bir süreç ve hücre fizyolojisi temel belirleyicisidir. Chemostats kullanılarak sürekli kültürü, hücre büyümesini ve ne kadar bu ağlar hücre büyümesini optimize etmek için moleküler evrim kontrol ağların çalışma kolaylaştırmak besin kısıtlaması hücre büyüme hızının dışsal kontrol edilmesini sağlar.
Abstract
Hücreler, dış dünyaya gelen sinyallerine yanıt olarak büyüme hızını düzenler. Hücre büyüdükçe, çeşitli hücresel işlemleri makromolekül sentezi, metabolizma ve hücre bölünmesi döngüsü sonunda, bağlılık içeren koordine edilmelidir. Kemostat, deneysel olarak hücre büyüme hızının kontrol edilmesi için bir yöntem olup, sistematik olarak okuyan bir araç sağlar ne kadar güçlü bir büyüme etkileri hücresel süreçleri – ve hücre büyüme hızını kontrol eden düzenleyici ağlar – gen ifadesi ve metabolizma da dahil olmak üzere. Kuşak chemostats yüzlerce muhafaza zaman, hücre büyümesini sınırlamaya çevre koşullarında mikropların uyarlanabilir evrimini incelemek için kullanılabilir. Biz, kemostat kültürlerin ilkesi tanımlamak çalışmalarını gösteren ve çeşitli uygulama örnekleri sağlar. Yirminci yüzyılın ortasında kendi girişten sonra kullanmama dönemi takiben, ile genom ölçekli metodolojileri yakınsama bir yenilenditerest hücre büyümesi ve adaptif evrim moleküler temelinin düzenlenmesinde biyolojik araştırma chemostats kullanımında bir rönesans uyarıcı olduğunu.
Introduction
Hücrelerin büyümesi, genetik ve çevresel faktörler 1,2 etkileşen kompleks ağlarda düzenlenir. Hücre büyümesi çok faktörlü yönetmelik çalışmada bir sistem düzeyinde yaklaşımı gerektirmektedir. Bununla birlikte, düzenlenmiş hücre büyümesinin sıkı çalışma deneysel olarak hücrelerin büyüme hızını kontrol zorluğu tarafından meydan. Ayrıca, hatta en basit deneylerde hücre-dışı koşullar, çoğaldıkları olarak hücreler sürekli olarak çevreyi değiştirmek sık olarak, dinamik ve karmaşıktır. , Tanımlanmış değişmez ve kontrollü ortamlarda hücre büyüme oranlarının deneysel kontrol edilmesini sağlar hücrelerin kültürlenmesi için bir yöntem: bu sorunlara bir çözüm, kemostat tarafından sağlanmaktadır.
Bir kemostat kullanarak sürekli kültür ait yöntem, bağımsız bir şekilde, 1950'de Monod 3 ve Novick ve Szilard 4 tarafından tanımlanmıştır. Aslen tasarlandığı gibi, hücreler con medya sabit bir ses yetiştirilentinually yeni medya eski ve ortam ve hücre eşzamanlı çıkarılması (Şekil 1) eklenerek seyreltildi. Akuple diferansiyel denklemler (Şekil 2) hücre yoğunluğunda (x) ve bir kap içinde, kemostat büyüme sınırlayıcı besin (ler) konsantrasyonundaki değişim oranını tarif eder. Önemlisi, denklem bu sistem kararlı durumda, hücrelerin (yani üstel büyüme hızı sabit) spesifik büyüme oranı oranına eşit olduğu olağanüstü ima ile bir tek (sıfır olmayan) kararlı kararlı durum (Şekil 3) tahmin bu da kültür (D) seyreltilir. Seyreltme oranı değiştirilerek, farklı büyüme oranları ve de besin sınırlama farklı koşullar altında hücrelerin kararlı hal popülasyonları kurmak mümkündür.
Chemostats kullanarak büyüme hızı deneysel kontrolü nasıl hücre fizyolojisi değişiklikleri bir anlayışın geliştirilmesi için kritikbüyüme 5,6 oranları ile. Ancak, mikrobiyolojik yöntemlerle bu eski dayanak yirminci yüzyılda moleküler biyoloji araştırma patlama sırasında giderek belirsiz hale geldi. Bugün, mikrop ve çok hücreli organizmalar ve sistemler düzeyinde analiz için genom ölçekli yöntemler gelişiyle hem de büyüme kontrolü ilgiyi chemostats kullanımı için motivasyon yeniledi. Burada, biz hücre büyüme oranlarının hassas kontrolü ve chemostats kullanarak benzersiz mümkündür dış ortama yararlanmak üç uygulamalarını tanımlamak. Transkript ve metabolitler olarak – – koordineli bir büyüme oranı ile düzenlenir İlk olarak, biyomoleküllerin binlerce bolluğu araştırmak için chemostats kullanılmasını tarif eder. İkinci olarak, chemostats rekabet deneyleri kullanılarak sınırlı besin ortamlarında, farklı genotipler arasında büyüme hızı farklılıkları hassas tahminleri elde etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar. Üçüncü olarak, biz tarif nasıl chemostats yapabilirsinizSürekli besin-fakir ortamlarda büyüyen hücrelerin adaptif evrimini incelemek için kullanılabilir. Bu örnekler chemostats çevre etkileşimleri ve adaptif evrim tarafından hücre büyüme regülasyonu, gen sistemleri düzeyinde soruşturma sağlayan hangi bir şekilde sergilemiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chemostats büyüme kontrollü kararlı hal koşulları mikropların ekimi etkinleştirin. Hücreler, değişmeyen bir dış çevre ile sonuçlanan sabit bir oranda sürekli olarak büyür. Bu durum, dış çevre, sürekli değişen ve hücre büyüme oranı çevre ve genotip karmaşık etkileşimi ile belirlenen küme kültür yöntemlerin aksine bulunmaktadır. Bu nedenle, toplu kültürler üzerinde chemostats içinde mikropları kültür önemli bir avantajı, deneysel olarak hücrelerin büyüme hızını kontrol e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma fonlar New York University oluşturmak başlatmak tarafından desteklenmiştir. Biz başlangıçta chemostats olarak Sixfors biyoreaktörlerin kullanımını geliştirdi Maitreya Dunham ve Matt Brauer teşekkür ederim.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Infors-HT Sixfors Chemostat | Appropriate Technical Resources, Inc. | ||
| Glass Bottle 9.5 L | Fisher Scientific | 02-887-1 | For Media Vessel and Hosing |
| Pinchcock | Fisher Scientific | 05-867 | For Media Vessel and Hosing |
| Stopper, Size 12, Green Neoprene | Cole-Palmer | EW-62991-42 | For Media Vessel and Hosing |
| Straight Connector | Cole-Palmer | EW-30703-02 | For Media Vessel and Hosing |
| General purpose ties 4 in | Fisher Scientific | NC9557052 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone Rubber | Small Parts | B000FMWTDE | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 3/8 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1Q | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 7/32 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1E | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD | McMaster-Carr | 6100K164 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD | McMaster-Carr | 6100K161 | For Media Vessel and Hosing |
| Hook Connectors | Fisher Scientific | 14-66-18Q | For Media Vessel and Hosing |
| Ratchet Clamp | Cole-Palmer | EW-06403-11 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Female | Cole-Palmer | EW-45512-34 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Male | Cole-Palmer | EW-45513-04 | For Media Vessel and Hosing |
| Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm | Fisher Scientific | MTGR05010 | For Media Vessel and Hosing |
| PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm | Fisher Scientific | NC9131037 | For Media Vessel and Hosing |
| Direct-Reading Flowtube for Air | Cole-Palmer | EW-32047-77 | For Nitrogen Gas Setup |
| Direct-Reading Flowtube for Nitrogen | Cole-Palmer | EW-32048-63 | For Nitrogen Gas Setup |
| Gas Proportioner Multitube Frames | Cole-Palmer | EW-03218-50 | For Nitrogen Gas Setup |
| Regulator, Two-Stage Analytical | Airgas | Y12-N145D580 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Adaptor, Stainless Steel | Airgas | Y99-26450 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Male Adaptor | Airgas | WES544 | For Nitrogen Gas Setup |
| Norprene Tubing | US Plastics | 57280 | For Nitrogen Gas Setup |
| Tripod Base | Cole-Palmer | EW-03218-58 | For Nitrogen Gas Setup |
| Valve Cartridges | Cole-Palmer | EW-03217-92 | For Nitrogen Gas Setup |
| Carboy 10 L | Fisher Scientific | 02-963-2A | For Media Preperation |
| Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size | Fisher Scientific | SCGP-T10-RE | For Media Preperation |
| Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size | Fisher Scientific | FB-800-100 | For Media Preperation |
| calcium chloride·2H2O | Fisher Scientific | C79-500 | Media Reagents |
| sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | Media Reagents |
| magnesium sulfate·7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | AC424205000 | Media Reagents |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | AC423400010 | Media Reagents |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | Media Reagents |
| boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Media Reagents |
| copper sulfate·5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Media Reagents |
| potassium iodide | Sigma Aldrich | 60400 | Media Reagents |
| ferric chloride·6H2O | Fisher Scientific | I88-100 | Media Reagents |
| manganese sulfate·H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| sodium molybdate·2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | Media Reagents |
| zinc sulfate·7H2O | Fisher Scientific | Z68-500 | Media Reagents |
| biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | Media Reagents |
| calcium pantothenate | Fisher Scientific | AC24330-1000 | Media Reagents |
| folic acid | Sigma Aldrich | F7876 | Media Reagents |
| inositol (aka myo-inositol) | Fisher Scientific | AC12226-1000 | Media Reagents |
| niacin (aka nicotinic acid) | Sigma Aldrich | N4126 | Media Reagents |
| p-aminobenzoic acid | Fisher Scientific | AC14621-2500 | Media Reagents |
| pyridoxine HCl | Sigma Aldrich | P9755 | Media Reagents |
| riboflavin | Sigma Aldrich | R4500-25G | Media Reagents |
| thiamine HCl | Fisher Scientific | BP892-100 | Media Reagents |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000-100G | Media Reagents |
| Uracil | Sigma Aldrich | U0750 | Media Reagents |
| Dextrose | Fisher Scientific | DF0155-08-5 | Media Reagents |
References
- Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. . Growth of the Bacterial Cell. , (1983).
- Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. . Cell Growth: Control of Cell Size. , (2004).
- Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
- Novick, A., Szilard, L. Description of the chemostat. Science. 112, 715-716 (1950).
- Kjeldgaard, N. O., Maaloe, O., Schaechter, M. The transition between different physiological states during balanced growth of Salmonella typhimurium. J. Gen. Microbiol. 19, 607-616 (1958).
- Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Control of macromolecular synthesis. , (1966).
- Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional Homeostasis in Batch and Steady-State. Culture of Yeast. Mol. Biol. Cell. 15, 4089-4104 (2004).
- Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Mol. Biol. Cell. 21, 198-211 (2010).
- Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., Piper, M. D. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 352-367 (2008).
- Gresham, D., et al. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18551-18556 (2010).
- Regenberg, B., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biol. 7, R107 (2006).
- Castrillo, J. I., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. J. Biol. 6, 4 (2007).
- Cipollina, C., et al. Revisiting the role of yeast Sfp1 in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study. Microbiology. 154, 337-346 (2008).
- Gresham, D., et al. System-level analysis of genes and functions affecting survival during nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae. Génétique. 187, 299-317 (2011).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10, e1001325 (2012).
- Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
- Gresham, D., et al. The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).
- Wenger, J. W., et al. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genet. 7, e1002202 (2011).
- Dunham, M. J., et al. Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16144-16149 (2002).
- Ronen, M., Botstein, D. Transcriptional response of steady-state yeast cultures to transient perturbations in carbon source. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 389-394 (2006).
- Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Mol. Sys. Biol. 2, 49 (2006).
- Tu, B. P., Kudlicki, A., Rowicka, M., McKnight, S. L. Logic of the yeast metabolic cycle: temporal compartmentalization of cellular processes. Science. 310, 1152-1158 (2005).
- Tzur, A., Kafri, R., LeBleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell Growth and Size Homeostasis in Proliferating Animal Cells. Science. 325, 167-171 (2009).
- Conlon, I., Raff, M. Size control in animal development. Cell. 96, 235-244 (1999).
- Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C. Extracellular control of cell size. Nat. Cell Biol. 3, 918-921 (2001).
- Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system. Science. 290, 1358-1360 (2000).
- Cohen, E. P., Eagle, H. A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture. J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).
