JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

في الوقت الحقيقي تحليلات النقل الريتينول بواسطة مستقبلات البروتين غشاء البلازما الريتينول ملزم

Published: January 28, 2013
doi:
10.3791/50169
, ,
1Department of Physiology, Jules Stein Eye Institute and Howard Hughes Medical Institute,University of California, Los Angeles

Summary

نحن هنا وصف تقنية الأمثل لإنتاج عالية الجودة فيتامين A معقدة RBP / واثنين من تقنيات الرصد في الوقت الحقيقي لدراسة فيتامين A النقل STRA6، ومستقبلات RBP.

Abstract

فيتامين A ضروري لرؤية و. النمو / التفريق بين جميع أجهزة الإنسان تقريبا الريتينول البلازما بروتين ملزمة (RBP) هو مبدأ والناقل محددة من فيتامين A في الدم. نحن هنا وصف تقنية محسنة لإنتاج وتنقية هولو-RBP واثنين من تقنيات الرصد في الوقت الحقيقي لدراسة النقل من فيتامين A من قبل مستقبلات RBP عالية تقارب STRA6. أول تقنية يجعل من الممكن لإنتاج كمية كبيرة من نوعية عالية هولو-RBP (100٪ محملة الريتينول) لفيتامين (أ) المقايسات النقل. عالية الجودة RBP أمر ضروري لفحوصات الفنية لتتجمع RBP النشرات فيتامين A تلوث بسهولة والبكتيرية في إعداد RBP يمكن أن يسبب التحف. جعلت تقنيات الرصد في الوقت الحقيقي مثل الكهربية إسهامات حاسمة في دراسات النقل الغشاء. لم يتم النقل RBP الريتينول مستقبلات بوساطة تحليلها في الوقت الحقيقي حتى وقت قريب. والأسلوب الثاني هو موضح هنا الجرميةل في الوقت تحليل الإفراج الريتينول STRA6 المحفزة أو التحميل. أسلوب الثالث هو في الوقت الحقيقي تحليل STRA6 المحفزة النقل من الريتينول هولو-RBP إلى الريتينول الخلوية I بروتين ملزمة (CRBP-I). هذه التقنيات توفر حساسية عالية في الكشف والقرار فيتامين A في RBP مستقبلات آلية الامتصاص.

Introduction

فيتامين A هو جزيء العضوية التي لا غنى عنها لبقاء الإنسان وحسن سير جميع أجهزة الإنسان تقريبا. فيتامين A المشتقات (الرتينوئيدات) المشاركة في مختلف الأحداث البيوكيميائية والخلوية بما في ذلك الاستشعار من الضوء لرؤية 1،2 وتنظيم التعبير الجيني والترجمة البروتين أثناء التطور الجنيني والكبار في الأنسجة 3-6. على الرغم من الريتينول لديه القدرة على نشر نظام ككل، وجاء مع تطور البلازما بروتين ملزمة الريتينول، وهو بروتين الناقل محددة لفيتامين (أ) النقل في الدم لتحقيق الكفاءة العالية والدقة وتجنب السمية المرتبطة نشر عشوائي 7-10. A مستقبلات عالية تقارب الممارسات التجارية التقييدية التي تربط لويستغرق فيتامين A كان الافتراض في 1970s و11-13. على الرغم من الأدلة المتراكمة منذ ثلاثة عقود على وجود مستقبلات RBP 14-31، وناقشت فرضية مستقبلات لسنوات عديدة نظرا لexistenc(ه) من تعريف غير صحيح من هولو-RBP. التعريف الصحيح للهولو-RBP هو أنه هو مجمع عالية تقارب بين الريتينول 01:01 والممارسات التجارية التقييدية. استخراج المتكررة من قبل هولو-RBP المذيبات العضوية ضروري لإنتاج APO-RBP. ويستخدم هذا التعريف من قبل مختبرات كلها تقريبا دراسة RBP 7،9،32-35 أو مستقبلات RBP 14-31،36-42. تعريف غير صحيح من هولو-RBP الذي تم استخدامه لدحض وجود مستقبلات RBP هو خليط من الريتينول الحاد الحرة مع APO-RBP. منذ وظيفة مستقبلات فيتامين A في RBP امتصاص من هولو-RBP هو الافراج عن الريتينول من هولو-RBP، فإن مستقبلات RBP تلعب أي دور في امتصاص فيتامين الريتينول إذا مجاني لتبدأ (على النحو الذي اقترحه تعريف غير صحيح من هولو -RBP).

دعا مؤخرا تحديد مستقبلات RBP باعتبارها multitransmembrane البروتين مجال STRA636 وظيفتها في امتصاص فيتامين A-من هولو RBP 36-43 يجادل بقوة ضد فرضية أن لا RBPتحتاج إلى مستقبلات فيتامين لتقديم تحليلات مفصلة A. كشفت أن لديها STRA6 المجالات عبر الغشاء 9 مع محطة تقع خارج الخلية-N وC-تقع محطة داخل خلوي 40. عبر الغشاء الواقع بين 6 و 7 هو مجال الممارسات التجارية التقييدية الأساسية ملزمة 39. ويقترن STRA6 على حد سواء والانتقال بعيد المدى المحددة CRBP-I في امتصاص فيتامين A-RBP من هولو، ولكن لا الانتقال بعيد المدى المحددة ولا CRBP-I. مطلوب للغاية لتعزيز النشاط STRA6 41 القدرة على تحفيز STRA6 الريتينول بيان من هولو-RBP هو المفتاح لفيتامين A في نشاط امتصاص 41. من خلال الاعتماد على STRA6 لاطلاق سراح الريتينول، ويمكن التسليم عن طريق فيتامين (أ) فيتامين (أ) نقل RBP لاستهداف الخلايا في الأنسجة الطرفية مع خصوصية عالية وكفاءة.

ويتضح على الأهمية الحاسمة لتعريف هولو-RBP وليس فقط عن طريق إعداد النقاش التاريخية على وجود مستقبلات RBP، ولكن أيضا من خلال الورقات الثلاث الأخيرة ذات الصلة على أساس تعريفات DIF-هولو RBPferent من التعريف الأصلي والصحيح 44-46. استخدام الورقة الأولى التعريف هولو-RBP التي تم استخدامها في رفض وجود مستقبلات RBP لدراسة مستقبلات RBP 44. جاء الأوراق الثاني والثالث إلى تعريف الثالث من هولو-RBP التي جعلت من أقل احتمالا لالريتينول إلى دراسة لتشكيل مجمع السليم مع RBP 45،46. أعدت هذه الدراسات عن طريق خلط 3 H-retinol/RBP هولو-RBP (ولا حتى APO-RBP) مع 3 H-الريتينول. وبما أن هذا الفحص لم ديك 3 H-retinol/RBP شكلت ولم إزالة المفرط مجانا 3 H-الريتينول 45،46، فإنه ليس مقايسة لامتصاص فيتامين H-3 من 3 H-retinol/RBP، ولكن هو حر 3 نشر الفحص H-الريتينول. فقد تبين في وقت سابق ان STRA6 لا يعزز امتصاص الخلوية من الريتينول مجانا من الانتقال بعيد المدى المحددة 38 أو CRBP-I 41. تقريبا لا بد لجميع الممارسات التجارية التقييدية الريتينول في الدم وعدم وجود كشف الصحائفه الريتينول. A المهمة الرئيسية للمستقبلات RBP هو تحفيز إطلاق الريتينول من هولو-RBP خلال امتصاص فيتامين إي من هولو-RBP 41. إذا تم الافراج بشكل مصطنع أو الريتينول في شكل حر لتبدأ 45،46، ليست هناك حاجة لمستقبلات RBP. النتائج مختلفة بشكل كبير تم الحصول عليها من فحص مجاني نشر الريتينول بالمقارنة مع المقايسات يعتمد على استعداد بشكل صحيح هولو-RBP توضيح أن إعداد الصحيح للRBP أمر حاسم لفحوصات جانه الفنية.

يمكن تنقيته من مصل الإنسان RBP 41، لكن الإجراء معقد والعائد منخفض. نهج بديل هو إنتاج RBP في E. القولونية. لأن E. القولونية ليس لديها القدرة على أضعاف بشكل صحيح الثدييات البروتينات يفرز مع أكثر من زوج واحد من السندات ثاني كبريتيد مثل RBP، لا بد من الممارسات التجارية التقييدية refold وتنقية البروتين مطوية بشكل صحيح. البروتينات تتجمع لا تتصرف بشكل مختلف عن RBP فقط مطوية تصحيحه في المقايسات المختلفة،ولكن يمكن أيضا أن يسبب تراكم البروتين أثناء التخزين. لنفس السبب، ويتم إنتاج سوى APO-RBP عالية الجودة من هولو-RBP. نحن هنا وصف بروتوكول الأمثل لانتاج عالية الجودة 100٪ RBP محملة الريتينول من خلال التعبير البكتيرية، طوي ثانية، وتنقية HPLC. HPLC تنقية ليس فقط يزيل RBP مطوية بشكل غير صحيح ولكن أيضا التلوث الجرثومي كبيرة القطع الأثرية التي يمكن أن تسبب خطورة إذا تم استخدام الممارسات التجارية التقييدية في المقايسات نقل الإشارة. وصفنا أيضا اثنين من تقنيات الرصد الحساسة في الوقت الحقيقي لدراسة الريتينول النقل STRA6. كل تقنيات تعتمد على الممارسات التجارية التقييدية ذات جودة عالية. نظرا لضيق المكان، والتقنيات الكلاسيكية المشعة فيتامين ريتينويد القاعدة والقائمة على HPLC لا وصف المقايسات امتصاص هنا.

Protocol

1. الإنتاج، وطوي ثانية، وتنقية HPLC من هولو-RBP تحويل BL-21cells مع ناقلات pET3a لإيواء [كدنا] RBP الإنسان مع البطاقات صاحب 6X على محطة-N. تحول زراعة BL-21 في الخلايا شاكر في C ° 37 في 40 مل مع وسائل الإعلام LB كربنيسيلين حتى OD في 600 نانومتر تص…

Representative Results

نقدم نتائج ممثلة هنا للهولو-RBP إنتاج وتنقية من قبل HPLC (الشكل 1)، في الوقت الحقيقي تحليل STRA6 المحفزة الإفراج الريتينول من هولو-RBP وتحميل الريتينول إلى APO-RBP (الشكل 2) في الوقت الحقيقي وتحليل STRA6 المحفزة الريتينول النقل من هولو-RBP لEGFP-CRBP-I (الشكل 3). <…

Discussion

نحن هنا لتبادل الإنتاج RBP الأمثل لبروتوكول RBP إنتاج وتنقية الإجراءات الحاسمة لتوليد RBP مطوية بشكل صحيح. نظرا لإمكانية الأنواع RBP تتجمع وجود كميات ضئيلة من البروتينات البكتيرية حتى في HPLC تنقية البكتيريا المنتجة RBP، فمن المفيد استخدام الممارسات التجارية التقييدية الأص…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح R01EY018144.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
guanidine hydrochloride EMD 5010
cystine Sigma C8755
cysteine Sigma C7352
EDTA Fisher BP118-500
Tris Fisher 7786-1
DTT EMD 3860
retinol Sigma R7632
carbenicillin Fisher BP2648-5
IPTG EMD 5810
PBS EMD 6508
NaCl Fisher BP358-10
Ni-NTA Qiagen 1018244
imidazole EMD 5720
heptane EMD HX0295-1
Blocker Casein Pierce 37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K) Millipore UFC901024
Microfluor-2 plate Fisher 14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710 Fisher 14-824-655
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crouch, R. K., Chader, G. J., Wiggert, B., Pepperberg, D. R. Retinoids and the visual process. Photochem. Photobiol. 64, 613-621 (1996).
  2. Travis, G. H., Golczak, M., Moise, A. R., Palczewski, K. Diseases caused by defects in the visual cycle: retinoids as potential therapeutic agents. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 469-512 (2007).
  3. Napoli, J. L. Biochemical pathways of retinoid transport, metabolism, and signal transduction. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 52-62 (1996).
  4. Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Sci STKE. 2006, pe10 (2006).
  5. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 8, 755-765 (2007).
  6. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat. Rev. Genet. 9, 541-553 (2008).
  7. Goodman, D. S., Sporn, M. B., Boberts, A. B., Goodman, D. S. . The Retinoids. 2, 41-88 (1984).
  8. Blomhoff, R., Green, M. H., Berg, T., Norum, K. R. Transport and storage of vitamin A. Science. 250, 399-404 (1990).
  9. Newcomer, M. E., Ong, D. E. Plasma retinol binding protein: structure and function of the prototypic lipocalin. Biochim. Biophys. Acta. 1482, 57-64 (2000).
  10. Quadro, L., Hamberger, L., Colantuoni, V., Gottesman, M. E., Blaner, W. S. Understanding the physiological role of retinol-binding protein in vitamin A metabolism using transgenic and knockout mouse models. Mol. Aspects Med. 24, 421-430 (2003).
  11. Heller, J. Interactions of plasma retinol-binding protein with its receptor. Specific binding of bovine and human retinol-binding protein to pigment epithelium cells from bovine eyes. J. Biol. Chem. 250, 3613-3619 (1975).
  12. Bok, D., Heller, J. Transport of retinol from the blood to the retina: an autoradiographic study of the pigment epithelial cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. Exp. Eye Res. 22, 395-402 (1976).
  13. Rask, L., Peterson, P. A. In vitro uptake of vitamin A from the retinol-binding plasma protein to mucosal epithelial cells from the monkey’s small intestine. J. Biol. Chem. 251, 6360-6366 (1976).
  14. Heller, M., Bok, D. A specific receptor for retinol binding protein as detected by the binding of human and bovine retinol binding protein to pigment epithelial cells. Am. J. Ophthalmol. 81, 93-97 (1976).
  15. Chen, C. C., Heller, J. Uptake of retinol and retinoic acid from serum retinol-binding protein by retinal pigment epithelial cells. J. Biol. Chem. 252, 5216-5221 (1977).
  16. Bhat, M. K., Cama, H. R. Gonadal cell surface receptor for plasma retinol-binding protein. A method for its radioassay and studies on its level during spermatogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 587, 273-281 (1979).
  17. Rask, L., Geijer, C., Bill, A., Peterson, P. A. Vitamin A supply of the cornea. Exp. Eye Res. 31, 201-211 (1980).
  18. Torma, H., Vahlquist, A. Vitamin A uptake by human skin in. 276, 390-395 (1984).
  19. Torma, H., Vahlquist, A. Uptake of vitamin A and retinol-binding protein by human placenta in vitro. Placenta. 7, 295-305 (1986).
  20. Pfeffer, B. A., Clark, V. M., Flannery, J. G., Bok, D. Membrane receptors for retinol-binding protein in cultured human retinal pigment epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1031-1040 (1986).
  21. Eriksson, U., et al. Increased levels of several retinoid binding proteins resulting from retinoic acid-induced differentiation of F9 cells. Cancer Res. 46, 717-722 (1986).
  22. Ottonello, S., Petrucco, S., Maraini, G. Vitamin A uptake from retinol-binding protein in a cell-free system from pigment epithelial cells of bovine retina. Retinol transfer from plasma retinol-binding protein to cytoplasmic retinol-binding protein with retinyl-ester formation as the intermediate step. J. Biol. Chem. 262, 3975-3981 (1987).
  23. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The interaction of retinol-binding protein with its plasma-membrane receptor. Biochem. J. 255, 561-569 (1988).
  24. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. The mechanism of uptake of retinol by plasma-membrane vesicles. Biochem. J. 255, 571-579 (1988).
  25. Shingleton, J. L., Skinner, M. K., Ong, D. E. Characteristics of retinol accumulation from serum retinol-binding protein by cultured Sertoli cells. Biochimie. 28, 9641-9647 (1989).
  26. Sivaprasadarao, A., Findlay, J. B. Structure-function studies on human retinol-binding protein using site-directed mutagenesis. Biochem. J. 300 (Pt. 2), 437-442 (1994).
  27. Melhus, H., Bavik, C. O., Rask, L., Peterson, P. A., Eriksson, U. Epitope mapping of a monoclonal antibody that blocks the binding of retinol-binding protein to its receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 210, 105-112 (1995).
  28. Smeland, S., et al. Tissue distribution of the receptor for plasma retinol-binding protein. Biochem. J. 305 (Pt. 2), 419-424 (1995).
  29. Sundaram, M., Sivaprasadarao, A., DeSousa, M. M., Findlay, J. B. The transfer of retinol from serum retinol-binding protein to cellular retinol-binding protein is mediated by a membrane receptor. J. Biol. Chem. 273, 3336-3342 (1998).
  30. Vogel, S., et al. Retinol-binding protein-deficient mice: biochemical basis for impaired vision. Biochimie. 41, 15360-15368 (2002).
  31. Liden, M., Eriksson, U. Development of a versatile reporter assay for studies of retinol uptake and metabolism in vivo. Exp. Cell Res. 310, 401-408 (2005).
  32. Kanai, M., Raz, A., Goodman, D. S. Retinol-binding protein: the transport protein for vitamin A in human plasma. J. Clin. Invest. 47, 2025-2044 (1968).
  33. Rask, L., et al. The retinol-binding protein. Scand. J. Clin. Lab Invest. Suppl. 154, 45-61 (1980).
  34. Monaco, H. L., Rizzi, M., Coda, A. Structure of a complex of two plasma proteins: transthyretin and retinol-binding protein. Science. 268, 1039-1041 (1995).
  35. Zanotti, G., Berni, R. Plasma retinol-binding protein: structure and interactions with retinol, retinoids, and transthyretin. Vitam. Horm. 69, 271-295 (2004).
  36. Kawaguchi, R., et al. A membrane receptor for retinol binding protein mediates cellular uptake of vitamin A. Science. 315, 820-825 (2007).
  37. Isken, A., et al. RBP4 Disrupts Vitamin A Uptake Homeostasis in a STRA6-Deficient Animal Model for Matthew-Wood Syndrome. Cell Metab. 7, 258-268 (2008).
  38. Golczak, M., et al. Metabolic basis of visual cycle inhibition by retinoid and nonretinoid compounds in the vertebrate retina. J. Biol. Chem. 283, 9543-9554 (2008).
  39. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Honda, J., Sun, H. An essential ligand-binding domain in the membrane receptor for retinol-binding protein revealed by large-scale mutagenesis and a human polymorphism. J. Biol. Chem. 283, 15160-15168 (2008).
  40. Kawaguchi, R., Yu, J., Wiita, P., Ter-Stepanian, M., Sun, H. Mapping the membrane topology and extracellular ligand binding domains of the retinol binding protein receptor. Biochimie. 47, 5387-5395 (2008).
  41. Kawaguchi, R., et al. Receptor-mediated cellular uptake mechanism that couples to intracellular storage. ACS Chem. Biol. 6, 1041-1051 (2011).
  42. Kawaguchi, R., Zhong, M., Kassai, M., Ter-Stepanian, M., Sun, H. STRA6-Catalyzed Vitamin A Influx, Efflux and Exchange. J. Membr. Biol. 245, 731-745 (2012).
  43. Ruiz, A., et al. Retinoid content, visual responses and ocular morphology are compromised in the retinas of mice lacking the retinol-binding protein receptor, STRA6. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 3027-3039 (2012).
  44. Berry, D. C., Jin, H., Majumdar, A., Noy, N. Signaling by vitamin A and retinol-binding protein regulates gene expression to inhibit insulin responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4340-4345 (2011).
  45. Berry, D. C., O’Byrne, S. M., Vreeland, A. C., Blaner, W. S., Noy, N. Cross Talk between Signaling and Vitamin A Transport by the Retinol-Binding Protein Receptor STRA6. Mol. Cell Biol. 32, 3164-3175 (2012).
  46. Berry, D. C., Croniger, C. M., Ghyselinck, N. B., Noy, N. Transthyretin blocks retinol uptake and cell signalling by the holo-retinol-binding protein receptor STRA6. Mol. Cell Biol. , (2012).
  47. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  48. Peterson, P. A., Berggard, I. Isolation and properties of a human retinol-transporting protein. J. Biol. Chem. 246, 25-33 (1971).
  49. Rask, L., Vahlquist, A., Peterson, P. A. Studies on two physiological forms of the human retinol-binding protein differing in vitamin A and arginine content. J. Biol. Chem. 246, 6638-6646 (1971).
  50. Koutalos, Y. Measurement of the mobility of all-trans-retinol with two-photon fluorescence recovery after photobleaching. Methods Mol. Biol. 652, 115-127 (2010).
  51. Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric measurement of the formation of all-trans-retinol in the outer segments of single isolated vertebrate photoreceptors. Methods Mol. Biol. 652, 129-147 (2010).
  52. Peterson, P. A., Rask, L. Studies on the fluorescence of the human vitamin A-transporting plasma protein complex and its individual components. J. Biol. Chem. 246, 7544-7550 (1971).
  53. Futterman, S., Heller, J. The enhancement of fluorescence and the decreased susceptibility to enzymatic oxidation of retinol complexed with bovine serum albumin, beta-lactoglobulin, and the retinol-binding protein of human plasma. J. Biol. Chem. 247, 5168-5172 (1972).

Tags

Retinol TransportPlasma Retinol Binding ProteinHolo-RBPSTRA6Real-time AnalysisElectrophysiologyCRBP-IVitamin A Transport Mechanism
check_url/fr/50169?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Kawaguchi, R., Zhong, M., Sun, H. Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein. J. Vis. Exp. (71), e50169, doi:10.3791/50169 (2013).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image