Em tempo real, análises de Transporte Retinol pelo receptor de membrana da proteína de Retinol Binding

Summary

Aqui descrevemos uma técnica otimizada para produzir produtos de alta qualidade vitamina A / complexo RBP e duas técnicas de monitoramento em tempo real para estudar a vitamina A STRA6 transporte, o receptor RBP.

Abstract

A vitamina A é essencial para a visão e o. Crescimento / diferenciação de quase todos os órgãos humanos Plasma proteína de ligação do retinol (RBP) e é o princípio portador específico da vitamina A no sangue. Aqui descrevemos uma técnica optimizada para produzir e purificar a holo-RBP e duas técnicas de monitorização em tempo real para o estudo do transporte da vitamina A por o receptor de alta afinidade RBP STRA6. A primeira técnica torna possível produzir uma grande quantidade de qualidade elevada de holo-RBP (100%-carregadas com retinol) para ensaios de transporte da vitamina A. RBP alta qualidade é essencial para ensaios funcionais devido misfolded RBP lançamentos vitamina A contaminação bacteriana e prontamente na preparação RBP pode causar artefactos. Técnicas de monitoramento em tempo real, como eletrofisiologia fizeram contribuições importantes para os estudos de transporte de membrana. A RBP mediada pelo receptor de transporte de retinol não tenha sido analisado em tempo real até recentemente. A segunda técnica aqui descrita é a real tempo de análise de STRA6 catalisada liberação retinol ou de carga. A terceira técnica é análise em tempo real de STRA6 catalisada transporte retinol de holo-RBP a proteína de ligação do retinol celular I (CRBP-I). Essas técnicas fornecem alta sensibilidade e resolução em revelar vitamina RBP receptor é um mecanismo de captação.

Introduction

A vitamina A é uma molécula orgânica que é essencial para a sobrevivência humana e para o bom funcionamento de quase todos os órgãos humanos. Derivados da vitamina A (retinóides) participar em diversos eventos bioquímicos e celulares, incluindo a detecção de luz para a visão e ^1,2 a regulação da expressão do gene e a tradução da proteína durante o desenvolvimento embrionário e em tecidos adultos ^3-6. Embora retinol tem a capacidade de se difundir por via sistémica, a evolução veio com plasma de proteína de ligação do retinol, uma proteína transportadora específica para a vitamina A no transporte de sangue para atingir a eficácia e especificidade elevadas e, para evitar a toxicidade associada a difusão aleatória ^7-10. Um receptor de alta afinidade que se liga a RBP e leva-se a hipótese de vitamina A no 1970 ^11-13. Apesar da evidência acumulada em três décadas sobre a existência do receptor RBP ^14-31, a hipótese do receptor foi debatida, durante muitos anos devido à existence de uma definição errada de holo-RBP. A definição correcta de holo-RBP é que é o complexo de alta afinidade de 1:1 entre retinol e RBP. Extracção repetida de holo-RBP por solvente orgânico é necessário para a produção de apo-RBP. Esta definição é utilizada por quase todos os laboratórios que estudam RBP ^7,9,32-35 ou o receptor RBP ^14-31,36-42. A definição incorrecta de holo-RBP que foi usado para provar a existência do receptor RBP é a mistura de retinol aguda livre com apo-RBP. Uma vez que a função do receptor RBP em vitamina A absorção de holo-RBP é a libertação a partir de retinol holo-RBP, o receptor RBP se não desempenham um papel na absorção de retinol se retinol é livre para começar (como proposto pela definição incorrecta de holo -RBP).

A recente identificação de receptor RBP como uma proteína de domínio multitransmembrane chamado STRA636 e a sua função em vitamina A absorção de holo-RBP ^36-43 fortemente argumenta contra a hipótese de que não RBPprecisa de um receptor para fornecer análises vitamina A. detalhada revelou que STRA6 tem 9 domínios transmembranares, com o terminal N localizado extracelularmente e C-terminal localizados intracelularmente ^40. Localizado entre transmembranar 6 e 7 é um domínio de ligação a RBP essencial ^39. STRA6 é acoplada a tanto LRAT e CRBP-I em vitamina A absorção do complexo de holo-RBP, mas nenhum nem LRAT CRBP-I é absolutamente necessário para a actividade melhorada STRA6 ^41. STRA6 capacidade de catalisar a liberação de retinol holo-RBP é a chave para a sua atividade de vitamina A captação de ^41. Confiando em STRA6 para libertar o seu retinol, a vitamina A entrega por RBP pode transportar a vitamina A para alvejar células em tecidos periféricos, com elevada especificidade e eficiência.

A importância crítica de holo-RBP definição e preparação é ilustrada não só pelo histórico debate sobre a existência do receptor RBP, mas também por três relacionados com estudos recentes com base no dif definições holo-RBPrentes da definição original e correta ^44-46. O papel utilizado pela primeira vez a definição holo-RBP, que foi utilizado para rejeitar a existência do receptor RBP para estudar o receptor RBP ^44. Os artigos segundo e terceiro veio com uma terceira definição de holo-RBP que tornou ainda menos susceptíveis de retinol a ser estudadas de modo a formar um complexo com boa RBP ^45,46. Estes estudos preparados através da mistura de ³ H-retinol/RBP holo-RBP (nem apo-RBP), com ³ H-retinol. Uma vez que este ensaio não tem ³ H-retinol/RBP formado e não remover excesso livre ³ H-retinol ^45,46, não é um ensaio de absorção de ^H-3 a partir de ³ H-retinol/RBP retinol, mas é livre ³ ensaio de difusão H-retinol. Foi demonstrado anteriormente que STRA6 não aumenta a absorção celular de retinol livre por LRAT ³⁸ ou CRBP-I ^41. Virtualmente todo o retinol é obrigado a RBP no sangue e não existe qualquer detectável free retinol. A principal função do receptor RBP é catalisar libertação retinol de holo-RBP retinol durante a captação de holo-RBP ^41. Se o retinol é artificialmente liberado ou está na forma livre, para começar ^45,46, o receptor RBP não é necessário. Os resultados dramaticamente diferentes obtidos a partir do ensaio de difusão livre de retinol em comparação com os ensaios baseados em correctamente preparado holo-RBP ilustram que uma correcta preparação de RBP é crucial para os seus ensaios funcionais.

RBP pode ser purificada a partir de soro humano ^41, mas o processo é complexo e o rendimento é baixo. Uma abordagem alternativa é a de produzir RBP em E. coli. Porque E. coli não tem a capacidade para dobrar correctamente mamíferos proteínas secretadas com mais de um par de ligações de dissulfureto como RBP, é essencial para a redobragem RBP e purificar a proteína correctamente dobrada. Proteínas deformadas não apenas um comportamento diferente do corrigido RBP dobrado em vários ensaios,mas também fazer com que a agregação da proteína durante a armazenagem. Pela mesma razão, a apo-RBP só é produzido a partir de alta qualidade holo-RBP. Descrevemos aqui um protocolo otimizado para produzir RBP de alta qualidade 100% carregado com retinol através da expressão bacteriana, redobramento, e purificação por HPLC. Purificação por HPLC, não só remove o RBP incorrectamente dobrado, mas também a contaminação bacteriana significativa que pode causar perturbações graves se RBP é usada em ensaios de transdução de sinal. Descrevemos também duas sensíveis técnicas de monitoramento em tempo real para estudar o transporte de retinol por STRA6. Ambas as técnicas dependem RBP alta qualidade. Devido a limitações de espaço, as técnicas clássicas de vitamina retinóide e baseada em HPLC baseado radioativo A captação de ensaios não são descritos aqui.

Protocol

1. Produção, redobragem e purificação por HPLC de Holo-RBP Transformar BL-21cells com o vector pET3a abrigando o ADNc para a RBP humano com sua etiqueta 6x no N-terminal. Crescer as transformadas BL-21 células em um agitador a 37 ° C em 40 ml de meio LB com carbenicilina até OD a 600 nm atingir 0,5. RBP induzir a expressão da proteína por adição de IPTG a 1 mM. Crescer as bactérias a 37 ° C mais 5 horas. RBP produzido em E. coli é principalmente presente nos corpos de inclusã…

Representative Results

Apresentamos aqui os resultados representativos para holo-RBP produção e purificação por HPLC (Figura 1), em tempo real A análise de STRA6 catalisada libertação retinol de holo-RBP e carregamento de retinol em apo-RBP (Figura 2) e análise em tempo real de STRA6 catalisada transporte retinol de holo-RBP a EGFP-CRBP-I (Figura 3). Sem a redobragem, RBP produzido em bactérias é quase completamente misfolded devido à presença de muita…

Discussion

Compartilhamos aqui um protocolo de produção otimizada RBP porque os procedimentos de produção e purificação da RBP são críticos para a geração de RBP corretamente dobrado. Dada a possibilidade de espécies RBP deformadas e a presença de quantidades residuais de proteínas bacterianas, mesmo em bactérias purificada por HPLC-produzidos RBP, é útil utilizar RBP nativa do soro para confirmar a conclusão relacionada a RBP. RBP urina, o qual está comercialmente disponível, é uma mistura complexa de várias …

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
guanidine hydrochloride	EMD	5010
cystine	Sigma	C8755
cysteine	Sigma	C7352
EDTA	Fisher	BP118-500
Tris	Fisher	7786-1
DTT	EMD	3860
retinol	Sigma	R7632
carbenicillin	Fisher	BP2648-5
IPTG	EMD	5810
PBS	EMD	6508
NaCl	Fisher	BP358-10
Ni-NTA	Qiagen	1018244
imidazole	EMD	5720
heptane	EMD	HX0295-1
Blocker Casein	Pierce	37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K)	Millipore	UFC901024
Microfluor-2 plate	Fisher	14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710	Fisher	14-824-655