En tiempo real de análisis de transporte de retinol en el receptor de la membrana de plasma Proteína Fijadora del Retinol

Summary

Aquí describimos una técnica optimizada para producir alta calidad complejo de vitamina A / RBP y dos técnicas en tiempo real de seguimiento para estudiar la vitamina A por STRA6 transporte, el receptor de las prácticas comerciales restrictivas.

Abstract

La vitamina A es esencial para la visión y el crecimiento / diferenciación de casi todos los órganos humanos. Plasma proteína de unión a retinol (RBP) es el principio y el soporte específico de la vitamina A en la sangre. Aquí se describe una técnica optimizada para producir y purificar holo-RBP y dos en tiempo real de técnicas de supervisión para estudiar el transporte de vitamina A por el receptor de alta afinidad RBP STRA6. La primera técnica hace que sea posible producir una gran cantidad de alta calidad holo-RBP (100%-cargado con retinol) para la vitamina A ensayos de transporte. RBP de alta calidad es esencial para ensayos funcionales porque misfolded RBP versiones vitamina contaminación bacteriana y fácilmente en la preparación RBP pueden causar artefactos. En tiempo real las técnicas de vigilancia como la electrofisiología han hecho contribuciones importantes a los estudios de transporte de membrana. La RBP receptor mediada por el transporte de retinol no se ha analizado en tiempo real hasta hace poco. La segunda técnica descrita aquí es la razónl análisis en tiempo de STRA6 catalizada por la liberación de retinol o de carga. La tercera técnica es analizar en tiempo real de STRA6 catalizada por transporte de retinol holo-RBP para celular proteína de unión a retinol I (CRBP-I). Estas técnicas proporcionan una alta sensibilidad y resolución en la revelación de receptor de la vitamina del RBP un ​​mecanismo de absorción.

Introduction

La vitamina A es una molécula orgánica que es esencial para la supervivencia y el buen funcionamiento de casi todos los órganos humanos. Derivados de vitamina A (retinoides) participar en diversos eventos bioquímicos y celulares, incluyendo la detección de luz de ^1,2 visión y la regulación de la expresión génica y la traducción de la proteína durante el desarrollo embrionario y en los tejidos adultos ^3-6. Aunque retinol tiene la capacidad de difusión en forma sistémica, evolución subió con plasma proteína de unión a retinol, una proteína portadora específica para la vitamina A de transporte en la sangre para lograr una alta eficiencia y especificidad, y para evitar la toxicidad asociada con la difusión ^7-10 aleatorio. Un receptor de alta afinidad que se une a la RBP y toma de vitamina A se planteó la hipótesis en la década de 1970 ^11-13. A pesar de la evidencia acumulada en tres décadas en la existencia del receptor RBP ^14-31, la hipótesis del receptor fue objeto de debate durante muchos años debido a la existence de una definición incorrecta de holo-RBP. La definición correcta de holo-RBP es que es el complejo 1:1 de alta afinidad entre el retinol y RBP. Extracción repetida de holo-RBP por disolvente orgánico es necesario para producir apo-RBP. Esta definición es utilizada por casi todos los laboratorios que estudian las prácticas comerciales restrictivas ^7,9,32-35 o el receptor de RBP ^14-31,36-42. La definición incorrecta de holo-RBP que se usó para refutar la existencia del receptor RBP es la mezcla aguda de retinol libre con apo-RBP. Dado que la función del receptor de la vitamina A RBP en la captación de holo-RBP es liberar retinol de holo-RBP, el receptor de RBP jugaría ningún papel en la absorción de retinol si retinol es libre de empezar (como propone la definición incorrecta de holo -RBP).

La reciente identificación de receptor RBP como una proteína de dominio multitransmembrane llamado STRA636 y su función en la absorción de vitamina A a partir de holo-RBP ^36-43 fuertemente argumenta en contra de la hipótesis de que no RBPnecesita un receptor para entregar vitamina A. análisis detallado reveló que STRA6 tiene 9 dominios de transmembrana con el extremo N-terminal situadas extracelularmente y C-terminal localizado intracelularmente ^40. Situado entre transmembrana 6 y 7 es un dominio esencial RBP unión ^39. STRA6 está acoplado tanto LRAT y CRBP-I en la absorción de vitamina A a partir de holo-RBP, pero tampoco LRAT ni CRBP-I es absolutamente necesario para la actividad mejorada STRA6 ^41. STRA6 capacidad para catalizar la liberación de retinol a partir de holo-RBP es la clave para su actividad de vitamina A captación ^41. Al basarse en STRA6 para liberar su retinol, la vitamina A entrega el RBP puede transportar la vitamina A para dirigir las células en los tejidos periféricos con alta especificidad y eficiencia.

La importancia crítica del holo-RBP definición y preparación se ilustra no sólo por el debate histórico sobre la existencia del receptor RBP, pero también por tres documentos relacionados recientes basados ​​en holo-RBP definiciones DIFrente de la definición original y correcto ^44-46. El papel utilizado por primera vez la definición holo-RBP que fue utilizado para desaprobar la existencia del receptor RBP para estudiar el receptor RBP ^44. Los periódicos segundo y tercero, se le ocurrió una tercera definición de holo-RBP que lo hizo aún menos probable de retinol a estudiar para formar un complejo adecuado con las prácticas comerciales restrictivas ^45,46. Estos estudios preparan mezclando ³ H-retinol/RBP holo-RBP (ni siquiera apo-RBP) con ³ H-retinol. Puesto que este ensayo no tenía ³ H-retinol/RBP formado y no eliminó excesivo libre ³ H-retinol ^45,46, no es un ensayo para ³ H-retinol captación de ³ H-retinol/RBP, pero es una libre ³ H-retinol difusión ensayo. Se ha demostrado previamente que STRA6 no mejora la captación celular de retinol libre por LRAT ³⁸ o CRBP-I ^41. Prácticamente todos retinol está obligado a RBP en la sangre y no hay detectable free retinol. Una función principal del receptor RBP es catalizar la liberación de retinol a partir de holo-RBP durante la absorción de retinol holo-RBP ^41. Si el retinol es artificialmente liberado o está en la forma libre de comenzar con ^45,46, el receptor RBP no es necesario. Los resultados drásticamente diferentes obtenidos a partir del ensayo de difusión libre de retinol en comparación con los ensayos basados ​​en correctamente preparado holo-RBP ilustrar que la preparación correcta de RBP es crucial para sus ensayos funcionales.

RBP puede purificar a partir de suero humano ^41, pero el procedimiento es complejo y el rendimiento es bajo. Un enfoque alternativo es producir RBP en E. Debido a que E. coli. coli no tiene la capacidad para plegar correctamente proteínas secretadas de mamíferos con más de un par de enlaces disulfuro como RBP, es esencial para prácticas comerciales restrictivas replegamiento y purificar la proteína correctamente plegada. Proteínas mal plegadas, no sólo se comportan de manera diferente de las prácticas comerciales restrictivas corregido doblada en varios ensayos,pero también causan la agregación de proteínas durante el almacenamiento. Por la misma razón, apo-RBP se produce solamente a partir de alta calidad holo-RBP. Se describe aquí un protocolo optimizado para producir RBP alta calidad 100% cargado con retinol a través de la expresión bacteriana, replegamiento y purificación por HPLC. La purificación por HPLC no sólo elimina el RBP incorrectamente plegado, sino también una importante contaminación bacteriana que puede causar artefactos serios si RBP se utiliza en ensayos de transducción de señales. También se describen dos sensibles en tiempo real las técnicas de monitoreo para estudiar el transporte de retinol en STRA6. Ambas técnicas dependen de las prácticas comerciales restrictivas de alta calidad. Debido a limitaciones de espacio, las técnicas clásicas de vitamina radiactivos retinoide y basado en HPLC basado-A ensayos de absorción no se describen aquí.

Protocol

1. Producción, replegamiento y purificación por HPLC de holo-RBP Transformar BL-21cells con el vector pET3a que alberga el cDNA humano para RBP con 6x His en el extremo N-terminal. Cultivar las transformadas BL-21 células en un agitador a 37 ° C en 40 ml de medio LB con carbenicilina hasta que la DO a 600 nm alcanza 0,5. Inducir la expresión de proteínas RBP mediante la adición de IPTG a 1 mM. Crecer las bacterias a 37 ° C otra 5 hr. RBP producida en E. coli es en su mayoría presen…

Representative Results

Presentamos aquí los resultados representativos de holo-RBP producción y purificación por HPLC (Figura 1), análisis en tiempo real de STRA6 catalizada por la liberación de retinol holo-RBP y la carga de retinol en apo-RBP (Figura 2) y el análisis en tiempo real de STRA6 catalizada retinol transporte de holo-RBP a EGFP-CRBP-I (Figura 3). Sin replegamiento, RBP producida en bacterias es casi completamente plegadas incorrectamente debido …

Discussion

Compartimos aquí un protocolo RBP producción optimizada por prácticas comerciales restrictivas procedimientos de producción y purificación son fundamentales para la generación de prácticas comerciales restrictivas correctamente plegada. Dada la posibilidad de que especies RBP mal plegadas y la presencia de cantidades traza de proteínas bacterianas incluso en HPLC purificada producidas por bacterias RBP, es útil usar RBP nativo a partir de suero para confirmar una conclusión relacionada con RBP. RBP orina, que …

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
guanidine hydrochloride	EMD	5010
cystine	Sigma	C8755
cysteine	Sigma	C7352
EDTA	Fisher	BP118-500
Tris	Fisher	7786-1
DTT	EMD	3860
retinol	Sigma	R7632
carbenicillin	Fisher	BP2648-5
IPTG	EMD	5810
PBS	EMD	6508
NaCl	Fisher	BP358-10
Ni-NTA	Qiagen	1018244
imidazole	EMD	5720
heptane	EMD	HX0295-1
Blocker Casein	Pierce	37528
Amicon Ultra 15 concentrator (MWCO 10 K)	Millipore	UFC901024
Microfluor-2 plate	Fisher	14-245-177
Hamilton syringe Gastight #1710	Fisher	14-824-655