高分子基因传递纳米粒子的纳米粒子跟踪分析和高通量流式细胞仪评价
Summary
纳米粒子跟踪分析（NTA）和高通量流式细胞仪来评价聚合物纳米基因传递的协议。 NTA用于表征的纳米粒子的粒径分布和每个粒子分布的质粒。高通量的基因传递的生物材料库，流式细胞仪，定量的转染效率评价。
Abstract
使用高分子纳米粒子的非病毒基因传递已经成为一个有吸引力的方法对基因疗法治疗遗传性疾病，再生医学的技术。与病毒不同，它具有显着的安全问题，聚合物纳米颗粒可以被设计为是无毒的，非免疫原性的，非诱变性，更容易合成，化学通用的，能够承载较大的核酸货物和可生物降解的和/或环境响应。的阳离子聚合物与带负电荷的DNA通过静电相互作用形成复合物的顺序为100nm的，通常被称为聚合物纳米颗粒的自组装。生物材料，用于以形成纳米级的聚阳离子基因传递纳米粒子的实例包括多聚赖氨酸，polyphosphoesters，聚（酰氨基胺）和聚乙烯亚胺（PEI），这是一种不可降解的关闭的，现成的阳离子性聚合物的核酸转1,3常用。聚（β-氨基酯）（PBAEs）是一个较新的类的阳离子聚合物4的水解降解的5,6，并已被证明是有效的基因传递到硬-转染的细胞类型，如人视网膜内皮的细胞（HRECs）7，小鼠乳腺上皮细胞，人脑肿瘤细胞和大血管内皮细胞（人类脐静脉内皮细胞）10。
一种新的协议来表征高分子纳米粒子，利用纳米粒子跟踪分析（NTA）。在这种方法中，得到的粒度分布和分布的每个粒子的数目的质粒11。此外，高吞吐量的96 – 孔板的聚合物纳米颗粒的转染效率进行快速筛选转染。在这个协议中，作为模型聚合物和人视网膜内皮的细胞（HRECs）的聚（β-氨基酯）（PBAEs）用作莫德尔人类细胞。这个协议可以很容易地适于评估任何聚合物纳米颗粒和感兴趣的任何类型的细胞中的多穴板的格式。
Introduction
每纳米粒子的复合物的质粒的数量的测定是很重要的设计有效的纳米粒子为基础的基因传递策略，特别是对于合作提供多个质粒给同一小区的目标，由于经常需要在干细胞重编程的研究12。已经描述了几种方法，来计算与一个单一纳米粒子的数目的质粒，每种方法都有缺点，用于估计13-16中所使用的技术。量子点（QD）标签结合TEM被用来估计每个粒子的质粒在基于壳聚糖的纳米粒子。估计这QD技术是复杂的，由于需要标记的DNA，这可能会改变其自组装特性;封装的未标记的DNA还没有直接检测的可能性;可能重叠的质粒和量子点在2D的颗粒的TEM图像;其他简化的假设13。另一种方法，是一个pplicable当排列的微颗粒中存在时，已被用来研究Lipopolyamine-DNA复合物，通过冷冻透射电子显微镜（冷冻TEM），X-射线散射，和动态光散射（DLS）14,15。不幸的是，这里考察的聚合物纳米颗粒材料，如用这种方法并不适用。 Collins 等人在另一项研究中，使用流动式粒子图像分析技术来研究（Lys）的16的含肽/ DNA复合物，但是，他们的方法只能评估较大，微米大小的颗粒16。因此，我们最近开发出一种新颖，灵活的检测，以量化的数量每11纳米粒子的质粒。
Protocol
Representative Results
Discussion
上述的协议描述评估转染效率的纳米颗粒的制剂，以及一种方法来表征的纳米粒子的粒径和DNA装载的方法。每个粒子的数目的质粒是一个重要的参数，该参数可以帮助预测粒子的有效性，也可以被用于剂量测定。纳米粒子跟踪分析，可以执行在一个范围内的不同的水溶液，如那些不同的盐浓度。这通常表征在PBS中进行，到模仿生理盐水。虽然在PBS中的尺寸可以得到一个良好的估计媒体或生理盐水?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢的TEDCO的MSCRF（2009-MSCRFE-0098-00）和美国国立卫生研究院R21CA152473的支持。
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
| Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
| PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
| Materials | |||
| Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
| C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA |
References
- Putnam, D. Polymers for gene delivery across length scales. Nature Materials. 5, 439-451 (2006).
- Sheyn, D., et al. Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).
- Green, J. J. Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery. Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).
- Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
- Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties. Mol. Pharm. , (2012).
- Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).
- Bhise, N. S., et al. The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures. Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).
- Tzeng, S. Y., et al. Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma. Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).
- Sunshine, J., et al. Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy. Adv. Mater. 21, 4947 (2009).
- Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles. Small. 8, 367-373 (2012).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).
- Kreiss, P., et al. Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency. Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).
- Pitard, B., et al. Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).
- Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery. Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).
- Green, J. J., et al. Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells. Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).
